En enkel protokoll for å trekke Hemocytes fra Wild Caterpillars
Summary
Insekt hemocytes utføre mange viktige funksjoner, både immune og ikke-immune, gjennom alle stadier av insekter utvikling. Vår nåværende kunnskap om hemocyte typer og funksjon kommer fra studier på insekt genetiske modeller. Her presenterer vi en metode for å trekke ut, kvantifisere og visualisere hemocytes fra ville larvene.
Abstract
Insect hemocytes (tilsvarer mammalske hvite blodlegemer) spiller en viktig rolle i flere fysiologiske prosesser gjennom et insekt livssyklus 1. I larvestadier av insekter som tilhører ordre fra Lepidoptera (møll og sommerfugler) og tovinger (sanne fluer), er hemocytes dannet fra lymph kjertel (en spesialisert blodkreft organ) eller embryonale celler og kan bli gjennomført til det voksne stadiet. Embryonale hemocytes er involvert i celle migrasjon under utvikling og chemotaxis regulering ved betennelse. De tar også del i celle apoptose og er avgjørende for embryogenese 2. Hemocytes megle cellenivå arm av insekt medfødte immunforsvaret som inkluderer flere funksjoner, for eksempel celle spredning, celle aggregering, dannelsen av knuter, fagocytose og innkapsling av utenlandske inntrengere 3. De er også ansvarlig for iscenesetter spesifikke insekt humorale forsvar under infeksjonen, som produksjon av antimikrobielle peptider og andre effektor molekyler 4, 5. Hemocyte morfologi og funksjon er i hovedsak blitt studert i genetiske eller fysiologisk insekt modeller, inkludert bananflue, Drosophila 6 melanogaster, 7, myggen Aedes aegypti og Anopheles gambiae 8, 9 og tobakk hornworm, Manduca 10 sexta, 11. Det finnes imidlertid lite informasjon foreløpig om mangfold, klassifisering, morfologi og funksjon av hemocytes i ikke-modell insektarter, særlig de hentet fra naturen 12.
Her beskriver vi en enkel og effektiv protokoll for å trekke hemocytes fra ville larvene. Vi bruker nest siste stadium Lithacodes fasciola (gul-shouldered slug møll) (figur 1) og Euclea delphinii (spiny eik slug) sommerfugllarver (Lepidoptera: Limacodidae) og viser at tilstrekkelige mengder hemolymph (insekt blod)kan bli isolert og hemocyte numre regnet fra individuell larver. Denne metoden kan brukes til å effektivt studere hemocyte typer i disse artene samt i andre relaterte lepidopteran sommerfugllarver høstes fra feltet, eller den kan lett kombineres med immunologiske analyser for å undersøke hemocyte funksjon etter infeksjon med mikrobiell eller parasittiske organismer 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoder for å trekke hemocytes fra medisinsk viktige insekter og lepidopteran modell insekter har tidligere blitt rapportert 9, 14. Hemocyte ekstraksjonsmetoder metoder tilpasses studentens insektarter, utviklingsstadiet av insekt og dens morfologiske egenskaper. For eksempel, kan hemolymph isolasjon fra Manduca larver lett utføres ved snipping den buede hornet nær slutten av buken 15. Fordi slug sommerfugllarver (Limacodidae) mangler denne abdominal strukturen, har vi utviklet en disti…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TMS ble støttet av Harlan Trust Fellowship (GWU) i denne studien. Midler til feltet innsamling og avl L. fasciola og E. delphinii ble levert av NSF stipend DEB 0642438 til JTL.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Borosilicate glass tubes | Sutter Instruments | B100-50-10 | OD: 1.0, ID: 0.50 mm |
| Grace’s Medium | Sigma | G8142 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH3007102 | Heat inactivated |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11252-40 | |
| Neubauer hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| Plastic tubing | Tri-Tech | TT-3-32OD | OD: 3/32”, ID: 1/32′ |
| Glass medical syringe | Fortuna Optima | D-97877 | 50 ml volume |
| Blunt end needle | Small Parts | NE-162PL-25 | 16 Gauge x 1″ length |
Referências
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 677 (2006).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (7), 542 (2007).
- Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15 (1), 1 (2008).
- Fauvarque, M. O., Williams, M. J. Drosophila cellular immunity: a story of migration and adhesion. J. Cell Sci. 124 (9), 1373 (2011).
- Nehme, N. T., Quintin, J., Cho, J. H., Lee, J., Lafarge, M. C., Kocks, C., Ferrandon, D. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).
- Ulvila, J., Vanha-Aho, L. M., Rämet, M. Drosophila phagocytosis – still many unknowns under the surface. APMIS. 119 (10), 651 (2011).
- Moreira, C. G., Regan, J. C., Zaidman-Remy, A., Jacinto, A., Praq, S. Drosophila hemocyte migration: an in vivo assay for directional cell migration. Methods Mol. Biol. 769, 249 (2011).
- Hillyer, J. F. Mosquito immunity. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 218 (2010).
- Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36 (12), 891 (2006).
- Jiang, H., Vilcinskas, A., Kanost, M. R. Immunity in lepidopteran insects. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 181 (2010).
- Eleftherianos, I., Xu, M., Yadi, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Plasmatocyte-spreading peptide (PSP) plays a central role in insect cellular immune defenses against bacterial infection. J. Exp. Biol. 212 (12), 1840 (2009).
- Ribeiro, C., Brehélin, M. Insect haemocytes: what type of cell is that. J. Insect Physiol. 52 (5), 417 (2006).
- Beetz, S., Brinkmann, M., Trenczek, T. Differences between larval and pupal hemocytes of the tobacco hornworm, Manduca sexta, determined by monoclonal antibodies and density centrifugation. J. Insect Physiol. 50 (9), 805 (2004).
- Beetz, S., Holthusen, T. K., Koolman, J., Trenczek, T. Correlation of hemocyte counts with different developmental parameters during the last larval instar of the tobacco hornworm, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 67 (2), 63 (2008).
- Eleftherianos, I., Joyce, S., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695 (2010).
- Qayum, A. A., Telang, A. A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (51), e2772 (2011).
