Ett enkelt protokoll för att extrahera hemocyter från Wild Larver
Summary
Insect hemocyter utför många viktiga funktioner, både immuna och icke-immuna, under alla stadier av insekter utveckling. Vår nuvarande kunskap om hemocyte typer och funktion kommer från studier av insekter genetiska modeller. Här presenterar vi en metod för att extrahera, kvantifiera och visualisera hemocyter från vilda larver.
Abstract
Insect hemocyter (motsvarande däggdjur vita blodkroppar) spelar en viktig roll i flera fysiologiska processer genom en insekt livscykel 1. I larvstadier av insekter som hör till order Lepidoptera (malar och fjärilar) och Diptera (riktiga flugor), är hemocyter bildas av lymfkörtelområde (en specialiserad hematopoetisk orgel) eller embryonala celler och kan genomföras till den vuxna stadiet. Embryonala hemocyter är involverade i cellmigration under utveckling och kemotaxi reglering vid inflammation. De tar också del i cell apoptos och är nödvändiga för embryogenes 2. Hemocyter medierar cellulära armen av insekten medfödda immunsvar som inbegriper flera funktioner, såsom cellspridning, cellaggregering, bildning av noduler, fagocytos och inkapsling av främmande inkräktare 3. De är också ansvariga för att iscensätta specifika insekter humorala försvar vid infektion, till exempel produktion av antimikrobiella peptider och andra effektormolekyler molekyler 4, 5. Hemocyte morfologi och funktion har huvudsakligen studerats i genetiska eller fysiologiska insekter modeller, inklusive bananfluga, Drosophila melanogaster 6, 7, myggor Aedes aegypti och Anopheles gambiae 8, 9 och tobak hornworm, Manduca sexta 10, 11. Det finns dock lite information för närvarande om mångfald, klassificering, morfologi och funktion hemocyter i icke-modell insektsarter, speciellt de som samlats in från det vilda 12.
Här beskriver vi en enkel och effektiv protokoll för att extrahera hemocyter från vilda larver. Vi använder näst sista stadiet Lithacodes Fasciola (gul-shouldered slug mal) (Figur 1) och Euclea delphinii (taggig ek slug) larver (Lepidoptera: Limacodidae) och visar att tillräckliga mängder hemolymfa (insekt blod)kan isoleras och hemocyte nummer räknas från enskilda larver. Denna metod kan användas för att effektivt studera hemocyte typer i dessa arter samt i andra ordningen fjärilar larver skördats från fältet, eller det kan lätt kombineras med immunologiska analyser som syftar till att undersöka hemocyte funktion efter infektion med mikrobiella eller parasitära organismer 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoder för att extrahera hemocyter från medicinskt viktiga insekter och fjärilsarter insekter modell har tidigare rapporterats 9, 14. Hemocyte extraktionsmetoder anpassas enligt de insektsarter, utvecklingsstadiet av insekten och dess morfologiska särdrag. Till exempel, kan hemolymfa isolering från Manduca larver lätt utföras genom snipping den krökta hornet nära slutet av buken 15. Eftersom slug larver (Limacodidae) saknar denna buken struktur har vi utvecklat en tydlig protokol…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TMS stöddes av Harlan Lita Fellowship (GWU) under denna studie. Finansiering för fältet insamling och avel L. Fasciola och E. delphinii lämnades av NSF bevilja DEB 0642438 till JTL.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Borosilicate glass tubes | Sutter Instruments | B100-50-10 | OD: 1.0, ID: 0.50 mm |
| Grace’s Medium | Sigma | G8142 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH3007102 | Heat inactivated |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11252-40 | |
| Neubauer hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| Plastic tubing | Tri-Tech | TT-3-32OD | OD: 3/32”, ID: 1/32′ |
| Glass medical syringe | Fortuna Optima | D-97877 | 50 ml volume |
| Blunt end needle | Small Parts | NE-162PL-25 | 16 Gauge x 1″ length |
Referências
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 677 (2006).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (7), 542 (2007).
- Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15 (1), 1 (2008).
- Fauvarque, M. O., Williams, M. J. Drosophila cellular immunity: a story of migration and adhesion. J. Cell Sci. 124 (9), 1373 (2011).
- Nehme, N. T., Quintin, J., Cho, J. H., Lee, J., Lafarge, M. C., Kocks, C., Ferrandon, D. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).
- Ulvila, J., Vanha-Aho, L. M., Rämet, M. Drosophila phagocytosis – still many unknowns under the surface. APMIS. 119 (10), 651 (2011).
- Moreira, C. G., Regan, J. C., Zaidman-Remy, A., Jacinto, A., Praq, S. Drosophila hemocyte migration: an in vivo assay for directional cell migration. Methods Mol. Biol. 769, 249 (2011).
- Hillyer, J. F. Mosquito immunity. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 218 (2010).
- Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36 (12), 891 (2006).
- Jiang, H., Vilcinskas, A., Kanost, M. R. Immunity in lepidopteran insects. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 181 (2010).
- Eleftherianos, I., Xu, M., Yadi, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Plasmatocyte-spreading peptide (PSP) plays a central role in insect cellular immune defenses against bacterial infection. J. Exp. Biol. 212 (12), 1840 (2009).
- Ribeiro, C., Brehélin, M. Insect haemocytes: what type of cell is that. J. Insect Physiol. 52 (5), 417 (2006).
- Beetz, S., Brinkmann, M., Trenczek, T. Differences between larval and pupal hemocytes of the tobacco hornworm, Manduca sexta, determined by monoclonal antibodies and density centrifugation. J. Insect Physiol. 50 (9), 805 (2004).
- Beetz, S., Holthusen, T. K., Koolman, J., Trenczek, T. Correlation of hemocyte counts with different developmental parameters during the last larval instar of the tobacco hornworm, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 67 (2), 63 (2008).
- Eleftherianos, I., Joyce, S., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695 (2010).
- Qayum, A. A., Telang, A. A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (51), e2772 (2011).
