Purificação Citometria de Fluxo com base em<em> S. cerevisiae</em> Zigotos
Summary
Para purificar de zigotos<em> S. cerevisiae</em>, Células haplóides do tipo de acasalamento oposto foram projetados para expressar vermelho ou verde proteínas fluorescentes, co-incubados, para permitir a formação do zigoto, e fracionado em um fluxo de protocolo de citometria de base. A fração altamente enriquecido permite posterior "-mico" estudos de recuperação, de progênie inicial, e investigação sistemática da morfogênese zigoto.
Abstract
Zigotos são intermediários essenciais entre haplóides e diplóides estados do ciclo de vida de muitos organismos, incluindo levedura (Figura 1) 1. S. cerevisiae zigotos resultado a partir da fusão de células haplóides de tipo de acasalamento diferente (MATa, MATalpha) e dar origem aos correspondentes diplóides estáveis que geram sucessivamente até 20 descendentes diplóides, como resultado das suas divisões mitóticas notavelmente assimétricas 2. Formação do zigoto é orquestrado por uma sequência complexa de eventos: Neste processo, os factores de acasalamento solúveis se ligam a receptores de cognato, desencadeando mediados por receptores cascatas de sinalização que facilitam a interrupção do ciclo celular e culmina na fusão célula-célula. Zigotos podem ser considerados um modelo para progenitor ou a função das células estaminais.
Embora muito se aprendeu sobre a formação de zigotos e, apesar de zigotos foram utilizados para investigar células-moleculares questões de interesse geral significance, quase todos os estudos fizeram uso de misturas de acasalamento em que os zigotos estão misturadas com uma população de maioria de células haplóides 3-8. Muitos aspectos da bioquímica da formação do zigoto ea vida continua do zigoto, portanto, permanecem sem investigação.
Relatos de purificação de zigotos levedura descrevem protocolos baseados nas suas propriedades de sedimentação 9, no entanto, este procedimento de sedimentação baseada não produziram cerca de 90% de pureza em nossas mãos. Além disso, ele tem a desvantagem de que as células são expostas ao sorbitol hipertónica. Por conseguinte, desenvolveram um processo de purificação versátil. Para este propósito, os pares de células haplóides que expressam proteínas de vermelho ou verde fluorescentes foram co-incubadas para permitir a formação do zigoto, colhidas a vários tempos e os zigotos resultantes foram purificadas utilizando um protocolo de triagem de citometria de fluxo com base. Esta técnica fornece uma avaliação visual conveniente de pureza e de maturação. A pureza médiada fracção é de cerca de 90%. De acordo com o tempo de colheita, os zigotos de diferentes graus de maturidade podem ser recuperados. As amostras purificadas fornecer um conveniente ponto de partida para "-OMIC" estudos, para a recuperação da progênie inicial, e para a investigação sistemática desta célula progenitora.
Protocol
Discussion
A disponibilidade de zigotos purificadas deve facilitar estudos bioquímicos incluindo transcriptômica, proteômica e lipidómica, bem como de investigação de mecanismos pelos quais se submetem zigotos ciclo celular re-entrada, remodelamento da parede celular, características de brotamento e de herança, etc Alternativamente, os zigotos podem ser gerados a partir com estirpes de portadores de mutações características em um ou ambos os pais. Além disso, os zigotos purificados, assim como para células haplóides …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Michael R. Sramkoski ajuda com citometria de fluxo, Purnima Dr. Jaiswal e Di Dr. Wu para início de entrada e Aylyarov Ilya ajuda com as ilustrações. Suportado pelo NIH Grant R01GM089872 e Citometria & Imaging Core Facility Microscopia do Caso Comprehensive Cancer Center (P30 CA43703).
Materials
| Reagent/Equipment | Source | Catalogue Number |
| pEG220, URA3/YIp, encoding cytoplasmic GFP 11) | E. Grote | |
| pAJ1661, URA3/CEN, encoding RPL25 fused to mCherry | A. Johnston | |
| Fisher FB120 sonicator | Fisher Scientific | |
| Polypropylene tube with strainer cap | BD Falcon | Ref 352235 |
| Refrigerated microfuge | Tomy | MRX-150 |
| Flow cytometry sheath solution | Biosure | 1027 |
| iCyt Reflection Model Flow Cytometer | Sony | |
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision | |
| Upright epifluorescence microscope | Leica | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-07 |
| CSM glucose formulation Notes: For agar plates, simply include 2% agar (Difco) |
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Referências
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