Heterotypische Driedimensionale<em> In Vitro</em> Modellering van Stroma-epitheliale interacties tijdens eierstokkanker initiatie en progressie
Summary
We beschrijven methoden voor het vaststellen<em> In vitro</em> Heterotypische driedimensionale modellen die ovarian fibroblasten en normale ovarium oppervlak of eierstokkanker epitheelcellen. We bespreken het gebruik van deze modellen stroma-epitheliale interacties die plaatsvinden tijdens eierstokkanker ontwikkeling te bestuderen.
Abstract
Epitheliale eierstokkanker (EOCs) zijn de belangrijkste oorzaak van overlijden door gynaecologische maligniteit in de westerse samenlevingen. Ondanks de vooruitgang in chirurgische behandelingen en verbeterde op platina gebaseerde chemotherapie, is er weinig verbetering in de EOC overlevingscijfers voor meer dan vier decennia 1,2. Terwijl stadium I tumoren hebben 5-jaarsoverleving> 85%, overleving voor stadium III / IV ziekte zijn <40%. Zo kan de hoge sterftecijfers voor EOC aanzienlijk worden verlaagd als tumoren werden aangetroffen bij eerder, meer behandelbaar, podia 3-5. Momenteel wordt de moleculaire genetische en biologische basis van beginnende ziekte ontwikkeling slecht begrepen. Meer in het bijzonder, is er weinig bekend over de rol van de micro-omgeving tijdens tumorinitiatie, maar bekende risicofactoren voor EOCs (zoals leeftijd en pariteit) suggereren dat de micro-omgeving een belangrijke rol speelt in de vroege ontstaan van EOCs. Daarom ontwikkelde drie-dimensionale heterotypische modellenvan zowel de normale eierstok van beginnende eierstokkanker. Voor de normale ovarium, we co-gekweekte normale ovarium oppervlak epitheel (IOSE) en normale stromale fibroblasten (INOF) cellen geïmmortaliseerd door retrovrial transductie van de katalytische subeenheid van menselijk telomerase holoënzym (hTERT) om de levensduur van deze cellen in kweek te verlengen. De vroegste stadia van eierstokepitheliaalcellen celtransformatie, overexpressie van het oncogen in CMYC IOSE cellen opnieuw samen gekweekt met cellen INOF model. Deze heterotypische modellen werden gebruikt om de effecten van veroudering en veroudering onderzoeken op de transformatie en invasie van epitheelcellen. Hier beschrijven we de methodologische stappen in de ontwikkeling van deze driedimensionale model, deze methoden zijn niet specifiek voor de ontwikkeling van normale ovarium en eierstokkanker weefsels en kan worden gebruikt om andere weefseltypes waar bestuderen stromale en epitheelcellen interacties fundamenteel aspect van het weefsel onderhoud en diSease ontwikkeling.
Protocol
Discussion
De biologie van een vroeg stadium ovariumcarcinoom (EOC) is slecht begrepen. Misschien is een van de voornaamste problemen op dit gebied vele jaren is het gebrek aan inzicht in de weefselspecifieke oorsprong van de ziekte, en het belang van de rol van de micro EOC in ontwikkeling. In de afgelopen jaren is wordt duidelijk geworden dat EOC is een heterogene ziekte met meerdere verschillende histophathological subtypes, waarschijnlijk met verschillende cellulaire oorsprong voor verschillende subtypes. Bijvoorbeeld, de huid…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd uitgevoerd bij de Keck School of Medicine, University of California, VS, en het University College London, Verenigd Koninkrijk. KL wordt gefinancierd door het National Institute of Health subsidie 5 U19 CA148112-02. BG werd gefinancierd door een projectsubsidie van de Eve beroep gynaecologische oncologie liefdadigheid (UK). Een deel van deze werkzaamheden die op UCLH / UCL werd gedeeltelijk gefinancierd uit het ministerie van Volksgezondheid de NIHR Biomedical Research Centre subsidieregeling.
Materials
| Reagent | Supplier | Catalogue Number |
| PolyHEMA, suitable for cell culture | Sigma Aldrich | P3932 |
| Molecular biology grade ethanol | Sigma Aldrich | E7023 |
| Sterile water for cell culture | VWR | 12001-356 |
| MCDB105 | Sigma Aldrich | M6395 |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 |
| Hyclone Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30088.03 |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1397 |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 |
| pBABE-hygro-hTERT | Addgene | 1773 |
| PBS | VWR | 12001-766 |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-072 |
| Cell strainer (40 or 70 μm) | VWR | 21008-949 21008-952 |
| Anti-fibroblast surface protein antibody, clone 1B10 | Sigma | F4771 |
| Anti-pan-cytokeratin antibody (C11) | Santa Cruz | sc-8018 |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 |
| TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS | Roche | 12013789001 |
| TeloTAGGG Telomere Length Assay | Roche | 12209136001 |
Table 1. Reagents and Equipment Referred to in this study.
Referências
- Jelovac, D., Armstrong, D. K. Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer. CA Cancer J. Clin. , (2011).
- Office for National Statistics. . Cancer Statistics registrations: registrations of cancer diagnosed in 2008. , (2011).
- Köbel, M., Kalloger, S. E., Santos, J. L. Tumor type and substage predict survival in stage I and II ovarian carcinoma: insights and implications. Gynecol. Oncol. 116, 50-56 (2010).
- Köbel, M., Kalloger, S. E., Boyd, N. Ovarian carcinoma subtypes are different diseases: implications for biomarker studies. PLoS Med. 5, e232 (2008).
- Smith, L. H., Morris, C. R., Yasmeen, S. Ovarian cancer: can we make the clinical diagnosis earlier. Cancer. 104, 1398-1407 (2005).
- Aviv, A., Hunt, S. C., Lin, J., Cao, X., Kimura, M., Blackburn, E. Impartial comparative analysis of measurement of leukocyte telomere length/DNA content by Southern blots and qPCR. Nucleic Acids Res. 39, e134 (2011).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repeat amplification protocol (TRAP. Nucleic Acids Res. 25, 2595-2597 (1997).
- Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E. Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer. Neoplasia. 12, 317-325 (2010).
- Lawrenson, K., Benjamin, E., Turmaine, M. In vitro three-dimensional modelling of human ovarian surface epithelial cells. Cell Prolif. 42, 385-393 (2009).
- Lawrenson, K., Sproul, D., Grun, B. Modelling genetic and clinical heterogeneity in epithelial ovarian cancers. Carcinogenesis. 32, 1540-1549 (2011).
- Grun, B., Benjamin, E., Sinclair, J. Three-dimensional in vitro cell biology models of ovarian and endometrial cancer. Cell Prolif. 42, 219-228 (2009).
- Zietarska, M., Maugard, C. M., Filali-Mouhim, A., Alam-Fahmy, M., Tonin, P. N., Provencher, D. M., Mes-Masson, A. M. Molecular description of a 3D in vitro model for the study of epithelial ovarian cancer (EOC. Mol. Carcinog. 46, 872-885 (2007).
- Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology. Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).
- Dafou, D., Grun, B., Sinclair, J. Microcell-mediated chromosome transfer identifies EPB41L3 as a functional suppressor of epithelial ovarian cancers. Neoplasia. 12, 579-589 (2010).
- Levanon, K., Crum, C., Drapkin, R. New insights into the pathogenesis of serous ovarian cancer and its clinical impact. J. Clin. Oncol. 26, 5284-5293 (2008).
- Kurman, R. J., Shih, I. e. M. Molecular pathogenesis and extraovarian origin of epithelial ovarian cancer–shifting the paradigm. Hum. Pathol. 42, 918-931 (2011).
