Heterotypic Tredimensjonal<em> In Vitro</em> Modellering av stromal-Epiteliale interaksjoner Ovarian Cancer initiering og progresjon
Summary
Vi beskriver metoder for å etablere<em> In vitro</em> Heterotypic tredimensjonale modeller som omfatter eggstokkene fibroblaster og normal ovarial overflate eller eggstokkreft epitelceller. Vi diskuterer bruken av disse modellene for å studere stromal-epiteliale interaksjoner som oppstår under eggstokkreft utvikling.
Abstract
Epiteliale eggstokkreft (EOCs) er den ledende dødsårsaken fra gynekologisk kreft i vestlige samfunn. Til tross for fremskritt innen kirurgiske behandlinger og forbedrede platina-baserte chemotherapies, har det vært lite forbedring i EOC overlevelse for mer enn fire tiår 1,2. Mens iscenesette jeg svulster har 5-års overlevelse> 85%, overlevelse for stadium III / IV sykdom er <40%. Dermed kunne de høye dødsrater for EOC bli vesentlig redusert hvis svulster ble oppdaget tidligere, mer treatable, scener 3-5. I dag er det molekylære genetiske og biologiske grunnlaget for tidlig stadium sykdommen utvikling dårlig forstått. Mer spesifikt, er lite kjent om rollen mikromiljøet under startfasen, men kjente risikofaktorer for EOCs (f.eks alder og paritet) tyder på at mikromiljøet spiller en nøkkelrolle i den tidlige dannelsen av EOCs. Vi har derfor utviklet tre-dimensjonale heterotypic modellerav både normale eggstokk og av tidlig fase eggstokkreft. For normal eggstokk, vi co-kultivert normal ovarian overflate epithelial (IOSE) og normal stromal fibroblast (INOF) celler, udødeliggjort av retrovrial transduksjon av den katalytiske subenheten av menneskelig telomerase holoenzyme (hTERT) å forlenge levetiden på disse cellene i kultur. Å modellere de tidligste stadier av eggstokkreft epitelcelleopprinnelse transformasjon, overuttrykte den CMYC onkogen i IOSE celler, igjen co-dyrket med INOF celler. Disse heterotypic modeller ble brukt for å undersøke effektene av aldring og senescence på transformasjon og invasjon av epitelceller. Her beskriver vi de metodiske trinnene i utviklingen av disse tre-dimensjonal modell, og disse metodene er ikke spesifikke for utvikling av normal eggstokk og eggstokkreft vev, og kan brukes til å studere andre vevstyper der stromale og epiteliale celle interaksjoner er et grunnleggende aspekt av vevet vedlikehold og diSease utvikling.
Protocol
Discussion
Biologi tidlig stadium ovarialcancer (EOC) er dårlig forstått. Kanskje en av de viktigste hindringer i dette feltet i mange år har vært mangel på forståelse av vev konkrete opprinnelsen til sykdommen, og av betydningen av den rollen mikromiljøet i EOC utvikling. I løpet av de siste årene, har er blitt klart at EOC er en heterogen sykdom med flere forskjellige histophathological undergrupper, sannsynligvis med ulike cellulære opprinnelse for ulike undergrupper. For eksempel, dagens data tyder på at høy grad s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble utført ved Keck School of Medicine, University of California, USA, og University College London, UK. KL er finansiert av National Institute of Health tilskudd 5 U19 CA148112-02. BG ble finansiert av et prosjekt stipend fra Eve Appeal gynekologisk onkologi veldedighet (UK). Noe av dette arbeidet utføres på UCLH / UCL ble delvis finansiering fra Department of Health NIHR Biomedical Research Centre støtteordning.
Materials
| Reagent | Supplier | Catalogue Number |
| PolyHEMA, suitable for cell culture | Sigma Aldrich | P3932 |
| Molecular biology grade ethanol | Sigma Aldrich | E7023 |
| Sterile water for cell culture | VWR | 12001-356 |
| MCDB105 | Sigma Aldrich | M6395 |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 |
| Hyclone Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30088.03 |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1397 |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 |
| pBABE-hygro-hTERT | Addgene | 1773 |
| PBS | VWR | 12001-766 |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-072 |
| Cell strainer (40 or 70 μm) | VWR | 21008-949 21008-952 |
| Anti-fibroblast surface protein antibody, clone 1B10 | Sigma | F4771 |
| Anti-pan-cytokeratin antibody (C11) | Santa Cruz | sc-8018 |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 |
| TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS | Roche | 12013789001 |
| TeloTAGGG Telomere Length Assay | Roche | 12209136001 |
Table 1. Reagents and Equipment Referred to in this study.
Referências
- Jelovac, D., Armstrong, D. K. Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer. CA Cancer J. Clin. , (2011).
- Office for National Statistics. . Cancer Statistics registrations: registrations of cancer diagnosed in 2008. , (2011).
- Köbel, M., Kalloger, S. E., Santos, J. L. Tumor type and substage predict survival in stage I and II ovarian carcinoma: insights and implications. Gynecol. Oncol. 116, 50-56 (2010).
- Köbel, M., Kalloger, S. E., Boyd, N. Ovarian carcinoma subtypes are different diseases: implications for biomarker studies. PLoS Med. 5, e232 (2008).
- Smith, L. H., Morris, C. R., Yasmeen, S. Ovarian cancer: can we make the clinical diagnosis earlier. Cancer. 104, 1398-1407 (2005).
- Aviv, A., Hunt, S. C., Lin, J., Cao, X., Kimura, M., Blackburn, E. Impartial comparative analysis of measurement of leukocyte telomere length/DNA content by Southern blots and qPCR. Nucleic Acids Res. 39, e134 (2011).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repeat amplification protocol (TRAP. Nucleic Acids Res. 25, 2595-2597 (1997).
- Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E. Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer. Neoplasia. 12, 317-325 (2010).
- Lawrenson, K., Benjamin, E., Turmaine, M. In vitro three-dimensional modelling of human ovarian surface epithelial cells. Cell Prolif. 42, 385-393 (2009).
- Lawrenson, K., Sproul, D., Grun, B. Modelling genetic and clinical heterogeneity in epithelial ovarian cancers. Carcinogenesis. 32, 1540-1549 (2011).
- Grun, B., Benjamin, E., Sinclair, J. Three-dimensional in vitro cell biology models of ovarian and endometrial cancer. Cell Prolif. 42, 219-228 (2009).
- Zietarska, M., Maugard, C. M., Filali-Mouhim, A., Alam-Fahmy, M., Tonin, P. N., Provencher, D. M., Mes-Masson, A. M. Molecular description of a 3D in vitro model for the study of epithelial ovarian cancer (EOC. Mol. Carcinog. 46, 872-885 (2007).
- Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology. Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).
- Dafou, D., Grun, B., Sinclair, J. Microcell-mediated chromosome transfer identifies EPB41L3 as a functional suppressor of epithelial ovarian cancers. Neoplasia. 12, 579-589 (2010).
- Levanon, K., Crum, C., Drapkin, R. New insights into the pathogenesis of serous ovarian cancer and its clinical impact. J. Clin. Oncol. 26, 5284-5293 (2008).
- Kurman, R. J., Shih, I. e. M. Molecular pathogenesis and extraovarian origin of epithelial ovarian cancer–shifting the paradigm. Hum. Pathol. 42, 918-931 (2011).
