Extraction des antigènes tissulaires de tests fonctionnels
Summary
Un protocole simple de préparation d'extraits de tissus humains pour être utilisées comme source d'antigènes à des cellules T fonctionnelles des essais est décrit. Cette méthode permet réponses des cellules T à des antigènes dérivés de tissus à mesurer<em> In vitro</em>.
Abstract
La plupart des antigènes cibles de la réponse immunitaire adaptative, reconnus par les cellules B et T, n'ont pas été définis 1. Cela est particulièrement vrai dans les maladies auto-immunes et le cancer 2. Notre objectif est d'étudier les antigènes reconnus par les lymphocytes T humains dans le type 1, diabète maladie auto-immune 1,3,4,5. Pour analyser des cellules T humaines réponses contre les tissus où les antigènes reconnus par les lymphocytes T ne sont pas identifiés, nous avons développé une méthode pour extraire les antigènes protéiques de tissus humains dans un format qui est compatible avec les analyses fonctionnelles 6. Réponses précédemment, des cellules T à des extraits de tissus non purifiés n'a pas pu être mesurée, car les méthodes d'extraction donner un lysat contenant des détergents qui étaient toxiques pour les cellules mononucléées du sang périphérique. Ici, nous décrivons un protocole d'extraction de protéines à partir de tissus humains dans un format qui n'est pas toxique pour les cellules T humaines. Le tissu est homogénéisé dans un mélange de butan-1-ol, l'acétonitrile et water (BAW). La concentration en protéines dans l'extrait de tissu est mesurée et une masse connue de protéine est mise dans des tubes. Après extraction, les solvants organiques sont éliminés par lyophilisation. Extraits de tissus lyophilisés peuvent être conservés jusqu'à leur utilisation. Pour une utilisation dans des tests de la fonction immunitaire, une suspension de cellules du système immunitaire, dans les milieux de culture appropriés, peuvent être ajoutés directement à l'extrait lyophilisé. La production de cytokines et la prolifération des PBMC par, en réponse à des extraits préparés en utilisant cette méthode, ont été faciles à mesurer. Par conséquent, notre méthode permet la préparation rapide des lysats de tissus humains qui peuvent être utilisés comme source d'antigènes dans l'analyse des réponses des cellules T. Nous suggérons que cette méthode va faciliter l'analyse des réponses immunitaires adaptatives des tissus de greffe, le cancer et l'auto-immunité.
Protocol
Discussion
Ce protocole a été développé parce que nous voulions produire un extrait de tissu humain qui est exempt de produits chimiques toxiques tels que les détergents. Plus précisément, nous avons utilisé pour préparer des extraits de tissus humains qui peuvent être utilisés dans des tests de la fonction immunitaire humain de vitro. Les extraits préparés en utilisant ce protocole peut également être reconstitué dans une solution tampon et utilisé pour de nombreuses analyses biochimiques, telle…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par des subventions de l'Australian National de Santé et Medical Research Council (NHMRC # 559007) et la Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) et le Programme d'infrastructure opérationnelle du gouvernement de Victoria. Nous remercions les membres du Tom Mandel Islet programme de l'équipe de transplantation d'isolement des îlots de fournir les tissus humains. Tissus humains ont été recueillis et utilisés avec l'approbation éthique local (Hôpital Saint-Vincent-de-HREC A 011/04 et de santé St. Vincent HREC-A 135/08).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 5 ml 12 x 75 mm sterile polystyrene tubes | BD Falcon | 352054 | |
| Caps for tubes polystyrene tubes (above) | BD Falcon | 352032 | |
| 50ml sterile tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| Acetonitrile | Mallinckradt Chemicals | 2856-10 | |
| Butan-1-ol | Sigma Aldrich | 537993-IL | |
| Homogenizer: PRO200 | Bio-strategy | 01-01200 | 10 x 115 mm saw-tooth generator |
| Lyophilizer | Virtis, Benchtop 4K | ||
| Sterile Needle 18-20 gauge | Becton Dickinson | REF 302032 | |
| CMRL-1066 Medium | Sigma | C0422 | |
| PBS | Sigma | D8537 |
Table 1. Specific reagents and equipment.
Referências
- Mannering, S. I. Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).
- Beckhove, P. Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation. J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).
- Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes. Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).
- Mannering, S. I. The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).
- Mannering, S. I. The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified. J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).
- Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays. Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).
- Mannering, S. I. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).
- Mannering, S. I. CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).
- Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide. Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).
- Peakman, M. Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes. Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).
- Honey, K., Rudensky, A. Y. Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation. Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).
