Um ensaio para a permeabilidade do neuroepitélio Zebrafish Embryonic
Summary
Nós descrevemos uma medição animal vivo todo quantitativa para a permeabilidade do cérebro de zebrafish embrionário. A técnica de análise da capacidade de retenção de fluido cerebrospinal e moléculas de diferentes pesos moleculares no interior do lúmen do tubo neural e quantifica o seu movimento para fora dos ventrículos. Este método é útil para a determinação de diferenças de permeabilidade epitelial e maturação durante o desenvolvimento e na doença.
Abstract
O sistema ventricular do cérebro é conservada entre vertebrados e é composto de uma série de cavidades interconectadas chamado ventrículos cerebrais, os quais formam, durante as primeiras fases do desenvolvimento do cérebro e são mantidas durante toda a vida do animal. O sistema ventricular do cérebro é encontrado em vertebrados, e os ventrículos se desenvolver após a formação do tubo neural, em que o lúmen central, enche-se de líquido cefalorraquidiano (LCR) 1,2. CSF é um líquido rico em proteínas que são essenciais para o desenvolvimento do cérebro e função normais 3-6.
No peixe-zebra, o cérebro de inflação ventrículo começa em cerca de 18 a fertilização pós hr (hpf), depois de o tubo neural está fechado. Vários processos estão associados com a formação de cérebro ventricular, incluindo a formação de um neuroepitélio, a formação da junção estanque, que regula a produção de permeabilidade e CSF. Nós mostramos que o Na, K-ATPase é necessária para a inflação do ventrículo cerebral, afectando todos estes processoses 7,8, ao passo 5a claudina é necessário para a formação da junção estanque 9. Além disso, mostramos que a "relaxamento" do neuroepitélio embrionário, através da inibição da miosina, está associada com a inflação do ventrículo cerebral.
Para investigar a regulação da permeabilidade durante zebrafish inflação ventrículo cerebral, foi desenvolvido um ensaio ventricular retenção de corante. Este método utiliza a injecção ventrículo cerebral em um embrião do peixe-zebra vivos, uma técnica anteriormente desenvolvido no nosso laboratório 10, a fluorescência rotular o fluido cerebrospinal. Os embriões são então trabalhada ao longo do tempo à medida que o corante fluorescente, através dos ventrículos cerebrais e neuroepitélio. A distância da frente de corante se afasta do basal (não luminal) do lado do neuroepitélio ao longo do tempo é quantificado e é uma medida da permeabilidade neuroepitelial (Figura 1). Observamos que corantes 70 kDa e menores vão percorrer a neuroepitélio e pode ser detected fora do cérebro embrionário do peixe-zebra a 24 hpf (Figura 2).
Este ensaio de retenção de corante pode ser usada para analisar a permeabilidade neuroepitelial em uma variedade de diferentes origens genéticas, em momentos diferentes durante o desenvolvimento, e após perturbações ambientais. Também pode ser útil para examinar a acumulação patológica de CSF. No geral, esta técnica permite aos pesquisadores analisar o papel e regulação da permeabilidade durante o desenvolvimento e doença.
Protocol
Discussion
Nós demonstrar a capacidade de quantificar a permeabilidade do cérebro embrionário do peixe-zebra vivos, tal como determinado por um corante injectado de um determinado peso molecular. A nossa observação de que o neuroepitélio zebrafish embrionária é diferencialmente permeável aos corantes de diferentes pesos moleculares sugere que o corante está a avançar através da permeabilidade paracelular. No entanto, não podemos descartar a possibilidade de uma contribuição para a permeabilidade transcelular observa…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional para a Saúde Mental, e da National Science Foundation. Agradecimentos especiais a membros do laboratório SIVE para muitas discussões úteis e críticas construtivas, e para Olivier Paugois para criação de peixes especialista.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number |
| Dextran, Fluorescein, Anionic, Lysine Fixable | Invitrogen | D7136, D7137, D1822, D1820, D1845 |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
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