Un saggio per permeabilità del neuroepitelio Zebrafish embrionali
Summary
Descriviamo un animale vivo misurazione quantitativa per tutta la permeabilità del cervello zebrafish embrionale. La tecnica analizza la capacità di mantenere fluido cerebrospinale e molecole di differenti pesi molecolari all'interno del lume del tubo neurale e quantifica loro movimento fuori dei ventricoli. Questo metodo è utile per determinare differenze di permeabilità epiteliale e maturazione durante lo sviluppo e la malattia.
Abstract
Il sistema ventricolare cerebrale è conservata tra vertebrati ed è composto da una serie di cavità interconnesse chiamati ventricoli cerebrali, che si formano durante le prime fasi di sviluppo del cervello e si mantengono per tutta la vita dell'animale. Il sistema ventricolare cerebrale si trova in vertebrati, e ventricoli svilupparsi dopo la formazione del tubo neurale, quando il lume centrale riempie di liquido cerebrospinale (CSF) 1,2. CSF è un liquido ricco di proteine, che è essenziale per il normale sviluppo del cervello e funzione 3-6.
In zebrafish, l'inflazione ventricolo del cervello inizia a circa 18 ore dopo la fecondazione (HPF), dopo che il tubo neurale è chiuso. Più processi sono associati con la formazione del cervello ventricolo, compresa la formazione di un neuroepitelio, formazione di giunzione a tenuta che regola la permeabilità e la produzione di CSF. Abbiamo mostrato che il Na, K-ATPasi è richiesto per gonfiaggio ventricolo cerebrale, impattando tutti questi processies 7,8, mentre la 5a claudina è necessario per la formazione di giunzione a tenuta 9. Inoltre, abbiamo dimostrato che "rilassamento" del neuroepitelio embrionale, attraverso l'inibizione della miosina, è connesso all'inflazione ventricolo cerebrale.
Per studiare la regolazione della permeabilità durante il gonfiaggio ventricolo cerebrale zebrafish, abbiamo sviluppato un colorante test ventricolare ritenzione. Questo metodo utilizza l'iniezione ventricolo del cervello in un embrione di zebrafish vivente, una tecnica già sviluppata nel nostro laboratorio 10, di etichettare fluorescente liquido cerebrospinale. Gli embrioni vengono poi ripresi nel corso del tempo come si muove il colorante fluorescente attraverso i ventricoli cerebrali e neuroepitelio. La distanza del fronte del colorante si allontana dal basale (non-luminale) lato del neuroepitelio nel tempo è quantificato ed è una misura della permeabilità neuroepiteliale (Figura 1). Osserviamo che i coloranti 70 kDa e piccoli si muoverà attraverso il neuroepitelio e può essere detected fuori del cervello zebrafish embrionale a 24 HPF (Figura 2).
Questo saggio ritenzione colorante può essere utilizzato per analizzare permeabilità neuroepiteliale in una varietà di differenti contesti genetici, in momenti diversi durante lo sviluppo, e dopo perturbazioni ambientali. Può anche essere utile per esaminare accumulo patologico di CSF. Nel complesso, questa tecnica consente agli investigatori di analizzare il ruolo e la regolazione della permeabilità durante lo sviluppo e la malattia.
Protocol
Discussion
Abbiamo dimostrato la capacità di quantificare permeabilità del cervello vivente zebrafish embrionale come determinato per un colorante iniettato di un dato peso molecolare. Nostra osservazione che neuroepitelio zebrafish embrionale è differenzialmente permeabile ai coloranti di differente peso molecolare suggerisce che il colorante si muove attraverso permeabilità paracellulare. Tuttavia, non si può escludere la possibilità di un contributo transcellulare alla permeabilità osservato. Questa tecnica può essere a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute for Mental Health, e la National Science Foundation. Un ringraziamento speciale ai membri di laboratorio esclusivo per molte utili discussioni e critiche costruttive, e per Olivier Paugois per la zootecnia, esperto di pesce.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number |
| Dextran, Fluorescein, Anionic, Lysine Fixable | Invitrogen | D7136, D7137, D1822, D1820, D1845 |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
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