En analys för Permeabilitet för zebrafisk Embryonal neuroepitelet
Summary
Vi beskriver en levande hela djuret kvantitativ mätning för permeabilitet embryonala zebrafisk hjärnan. Tekniken analyserar förmågan att kvarhålla cerebrospinalvätska och molekyler av olika molekylvikter inom neuralrörsdefekter lumen och kvantifierar deras rörelse ut ur kamrarna. Denna metod är användbar för att bestämma skillnader i epitelial permeabilitet och mognad under utveckling och sjukdom.
Abstract
Hjärnan ventrikulära systemet är konserverad bland ryggradsdjur och består av en serie sammankopplade hålrum som kallas ventriklar i hjärnan, som bildas under de tidigaste stadierna av hjärnans utveckling och bibehålls under hela djurets liv. Hjärnan ventrikulära systemet hittas i ryggradsdjur, och ventriklarna utvecklas efter neuralröret bildning, när den centrala lumen fylls med cerebrospinalvätska (CSF) 1,2. CSF är en proteinrik vätska som är nödvändig för normal utveckling av hjärnan och funktion 3-6.
I zebrafisk, börjar hjärnan ventrikeln inflation på ungefär 18 timmar efter befruktning (HPF), efter det neurala röret stängt. Flera processer är förknippade med hjärnan kammare bildas, bland annat bildandet av en neuroepitelet, stram korsning formation som reglerar permeabilitet och CSF-produktion. Vi visade att Na, K-ATPas som krävs för hjärnans ventrikel inflationen påverkar alla dessa processeres 7,8, medan Claudin 5a är nödvändig för tät korsning bildas 9. Dessutom visade vi att "avkoppling" av embryonala neuroepitelet, via hämning av myosin, är förknippad med hjärnan kammare inflationen.
För att undersöka regleringen av permeabiliteten under zebrafisk hjärnan kammare inflation har vi utvecklat en ventrikulär analys färg retention. Denna metod använder injektion hjärna kammare i en levande zebrafisk embryo, en teknik som tidigare utvecklats i vårt labb 10, för att fluorescerande märka cerebrospinalvätskan. Embryon sedan avbildas med tiden, eftersom fluorescerande färgämnet förflyttas genom ventriklar i hjärnan och neuroepitelet. Avståndet färgfronten rör sig bort från den basala (icke-luminala) sidan av neuroepitelet över tiden kvantifieras och är ett mått på neuroepiteliala permeabilitet (figur 1). Vi observerar att färgämnen 70 kDa och mindre kommer gå igenom neuroepitelet och kan detected utanför den embryonala zebrafisk hjärnan vid 24 HPF (Figur 2).
Detta färgämne kvarhållande analys kan användas för att analysera neuroepiteliala permeabilitet i en mängd olika genetiska bakgrunder, vid olika tidpunkter under utveckling, och efter miljö störningar. Det kan också vara användbart för att undersöka patologisk ansamling av CSF. Sammantaget gör denna teknik utredare att analysera vilken roll och reglering av permeabilitet under utveckling och sjukdom.
Protocol
Discussion
Vi visa förmåga att kvantifiera permeabilitet levande embryonala zebrafisk hjärna som fastställts för en injicerad färg av en viss molekylvikt. Vår observation att den embryonala zebrafisk neuroepitelet är differentiellt genomsläpplig för färgämnen med olika molekylvikt tyder på att färgämnet går via paracellulär permeabilitet. Däremot kan vi inte utesluta möjligheten av ett transcellulär bidrag till den observerade permeabilitet. Denna teknik kan tillämpas på varje annan rörformig struktur, så l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av det nationella institutet för mental hälsa, och National Science Foundation. Ett särskilt tack till Sive lab medlemmar för många nyttiga diskussioner och konstruktiv kritik, och till Olivier Paugois för sakkunnig fisk djurhållning.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number |
| Dextran, Fluorescein, Anionic, Lysine Fixable | Invitrogen | D7136, D7137, D1822, D1820, D1845 |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
Referências
- Harrington, M. J., Hong, E., Brewster, R. Comparative analysis of neurulation: first impressions do not count. Mol. Reprod. Dev. 76, 954-965 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Strategies of vertebrate neurulation and a re-evaluation of teleost neural tube formation. Mech. Dev. 121, 1189-1197 (2004).
- Salehi, Z., Mashayekhi, F. The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study. Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).
- Martin, C. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).
- Lehtinen, M. K. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69, 893-905 (2011).
- Gato, A. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).
- Lowery, L. A., Sive, H. Totally tubular: the mystery behind function and origin of the brain ventricular system. Bioessays. 31, 446-458 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Zhang, J. Establishment of a neuroepithelial barrier by Claudin5a is essential for zebrafish brain ventricular lumen expansion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1425-1430 (2010).
- Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish brain ventricle injection. J. Vis. Exp. , (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research. Nucleic Acids Research. 29, 87-90 (2001).
