Biz fare embriyolarının programlanmış hücre ölümü bölgeleri (PCD) ve LysoTracker adlı oldukça çözünür boya kullanarak embriyonik kök (ES) hücre kültürleri ayırt görselleştirmek için basit bir protokol mevcut.
Programlanmış hücre ölümü (PCD) normal doku homeostazı muhafaza etmek ve embriyolojik gelişimi sırasında doku ve organların 1,2,6,7 şekillendirmeye yetişkinlerde görülür. Gelişimi sırasında, toksik kimyasallar ve genetik değişiklikler PCD bir artışa neden olabilir veya gelişimsel anomalileri ve doğum kusurlarına 3-5 sonuçlanan PCD kalıplarını değiştirebilirsiniz. Bu defektlerin etyolojisi anlamak için, embriyo çalışmada embriyonik kök (ES) hücreler ayırt kullanabilirsiniz in vitro tayinlerde ile tamamlanabilir.
Apoptoz kaspaz enzim kaskad etkinleştirmek için sinyal içsel ve dışsal hem de içerir PCD iyi çalışılmış şeklidir. Karakteristik hücre değişiklikleri zarı blebbing, nükleer daralma ve DNA fragmantasyonu içerir. PCD diğer formları kaspaz aktivasyonunun içermeyen ve uzun otofaji ve nihai sonucu olabilir. Ne olursa olsun PCD yolunun, ölen hücrelerin çıkarılması gerekir. Erişkinlerde, bağışıklık hücrelerinin perfembriyolarda, bağışıklık sistemi henüz oluşmamış, nerede kaldırma alternatif bir mekanizma ile oluşur ise, bu fonksiyonu yapýnýz. Bu mekanizma alarak komşu hücreleri ("non-profesyonel fagositler" denir) içeren bir fagositik rol onlar ölüyor hücre ve yutmak 8-10 yüzeyinde sinyal 'ye beni' tanır. Yutulma sonra, kalıntı bozulması için lizozom getirilir. Böylece bağımsız PCD mekanizması, lizozomal aktivite artışı artan hücre ölümü ile ilişkili olabilir.
PCD, kalın dokular ve çok katmanlı ayırt kültürlerde lizozomlar görselleştirmek için basit bir tahlil incelemek yararlı olabilir. LysoTracker bu tür boya lizozom 11-13 gibi asidik hücre içi bölmeler içinde tutulan bir yüksek derecede çözünür küçük bir moleküldür. Boya difüzyon ile ve dolaşım yoluyla alınır. Penetrasyon kalın dokular ve çok katmanlı kültürlerinde PCD bir engel, görselleştirme olmadığı 12,13 mümkündür </> sup. Işlem, bir terminalin giriş / geçirgenlik transferaz gerektirir çünkü aksine, TUNEL (Terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP çentik uç etiketleme) analizi, 14, küçük örnekler, histolojik bölümler ve tek tabakalı kültürler ile sınırlıdır.
Yayılır ve çözücüler tarafından çözülür Anilin mavisi, aksine, LysoTracker Kırmızı DND-99 düzeltilebilir, parlak, ve kararlı. Boyama bütün montaj veya sulu veya çözücü bazlı montaj medya 12,13 kullanarak bölümünde standart floresan veya konfokal mikroskopi ile görüntülenebilmektedir. Burada normal ve sonik kirpi boş fare embriyolarının PCD bakmak için bu boya kullanılarak protokolleri tanımlar. Buna ek olarak, ES hücre kültürlerinde ayırt PSD analizi gösteren basit bir miktar yöntem sunuyoruz. Özet olarak, LysoTracker boyama PCD saptanmasında diğer yöntemler için büyük bir tamamlayıcı olabilir.
Apoptoz Önemli diğerlerinden ayıran kaspaz aktivitesinin tespiti ile birlikte TUNEL yöntemi ile DNA hasar tespiti, (mAb veya ZVAD-FMK olarak bağlayıcı bir molekül ile algılanır), hücresel değişikliklerin gözlenmesi ve fosfatidilserin sunumu (PS dahil membran yüzeyinde) (Annexin V bağlama tarafından algılanır). Bu testlerin her biri ile bazı dezavantajları vardır. Örneğin, TUNEL yöntemi içinde kullanılan terminal transferaz birkaç hücre tabakası ötesine nüfuz etmez. Ayrıca Annexin V gibi …
The authors have nothing to disclose.
Biz protokol düzenleme yardım Mariani laboratuar üyeleri ederim. Bu çalışma CIRM Doktoraüstü Eğitim Grant (JLF), bir CIRM KÖPRÜLER staj (TZTT), Robert E. ve Mayıs R. Wright Vakfı (FVM) ve Güney Kaliforniya Üniversitesi (FVM) tarafından finanse edildi.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | |||||||||||||||
LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | #L-7528 | |||||||||||||||
Hanks BSS | Invitrogen | 14025-076 | |||||||||||||||
Paraformaldehyde | EMD | EM-PX0055-3 | |||||||||||||||
Vectashield | VECTOR | H-1200 | |||||||||||||||
DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |||||||||||||||
Non-essential amino acids | Cellgro | 25-025-CI | |||||||||||||||
Sodium pyruvate | Cellgro | 25-000-CI | |||||||||||||||
FBS | Hyclone | SH30071.02 | |||||||||||||||
Pen-Strep | Invitrogen | 15140-122 | |||||||||||||||
b-Mercaptoethanol, 50 mM | Invitrogen | 21985-023 | |||||||||||||||
LabTek-II Chamber slides (8-well) |
Nalge Nunc International | 154534 | |||||||||||||||
0.1% Gelatin | Millipore | ES-006-B | |||||||||||||||
Dulbecco’s PBS (D-PBS) | Cellgro | 21-031-CV | |||||||||||||||
Solution Recipes 4% Paraformaldehyde For 100 ml:
WARNING: Paraformaldehyde in ‘frill’ form (compressed small pellets) is less powdery and can therefore be measured outside of a hood. However you should still wear a protective dust mask (N95 at least) during handling. EB Culture Media For 500 ml EB Media:
|