L'uso di LysoTracker per rilevare la morte cellulare programmata in embrioni e differenziazione delle cellule staminali embrionali

Summary

Vi presentiamo un protocollo semplice per visualizzare le regioni di morte cellulare programmata (PCD) in embrioni di topo e di differenziazione staminali embrionali (ES) colture cellulari utilizzando un colorante chiamato LysoTracker altamente solubile.

Abstract

La morte cellulare programmata (PCD) si verifica negli adulti per mantenere l'omeostasi dei tessuti normali e durante lo sviluppo embrionale di modellare i tessuti e gli organi ^1,2,6,7. Durante lo sviluppo, prodotti chimici tossici o alterazioni genetiche possono causare un aumento di PCD o modificare i modelli di PCD con conseguente sviluppo di anomalie e difetti di nascita ^3-5. Per comprendere l'eziologia di questi difetti, lo studio di embrioni può essere completata con prove in vitro che utilizzano differenziare staminali embrionali (ES) cellule.

L'apoptosi è un ben studiato forma di PCD che coinvolge sia intrinseca ed estrinseca segnalazione per attivare l'enzima caspasi cascata. Alterazioni cellulari caratteristici sono blebbing membrana, restringimento nucleare, e la frammentazione del DNA. Altre forme di PCD non coinvolgono l'attivazione delle caspasi e possono essere il risultato finale di autofagia prolungata. Indipendentemente dal percorso PCD, cellule morenti devono essere rimossi. Negli adulti, le cellule immunitarie perfOrm questa funzione, mentre in embrioni, in cui il sistema immunitario non ha ancora sviluppato, la rimozione avviene con un meccanismo alternativo. Questo meccanismo comporta cellule vicine (chiamati "non professionali fagociti") assume un ruolo-fagocitica riconoscono il 'mangiami' segnale sulla superficie della cellula morente e inghiottire lo ^8-10. Dopo immersione, i detriti viene portato lisosomi per la degradazione. Quindi indipendentemente meccanismo PCD, un aumento dell'attività lisosomiale può essere correlata con la morte cellulare aumentata.

Per studiare PCD, un test semplice per visualizzare lisosomi nei tessuti spessi e multistrato culture differenziazione può essere utile. Colorante LysoTracker è una molecola altamente solubile piccola che è trattenuto in acidi compartimenti subcellulari come il lisosoma ^11-13. Il colorante viene ripreso per diffusione e attraverso la circolazione. Dal momento che la penetrazione non è una, la visualizzazione ostacolo di CPS nei tessuti spessi e multistrato culture è possibile ^12,13 </sup>. Al contrario, TUNEL (Terminal deossinucleotidil transferasi dUTP etichettatura fine nick) analisi ^14, è limitata a piccoli campioni, sezioni istologiche, e culture monostrato perché la procedura richiede l'inserimento / permeabilità di un terminale transferasi.

In contrasto con anilina blu, che si diffonde e si dissolve da solventi, LysoTracker Red ND-99 è risolvibile, luminoso, e stabile. La colorazione può essere visualizzato con un microscopio a fluorescenza o confocale in tutto-mount o sezione utilizzando un mezzo di montaggio acquoso o solvente ^12,13. Qui descriviamo i protocolli che utilizzano questo colorante a guardare la CPS in condizioni normali e Sonic hedgehog embrioni di topo null. Inoltre, dimostriamo analisi di PCD in colture di cellule ES differenziare e presentare un metodo semplice di quantificazione. In sintesi, la colorazione LysoTracker può essere un ottimo complemento ad altri metodi di rilevazione PCD.

Protocol

1. Colorazione LysoTracker di embrioni di topo Generazione di embrioni di topo inserendo giovani (5-6 settimana fa) femmine in gabbie prigionieri di sesso maschile. Monitorare il mattino seguente per la comparsa di un tappo vaginale che indica che si è verificato l'accoppiamento. Se la femmina è incinta, a mezzogiorno in quel giorno si chiama 0,5 dpc (giorni dopo il coito). La procedura qui presentata è l'ideale per gli embrioni 7-13 DPC. Il giorno embrionale di interesse, l'eutanasia…

Discussion

Caratteristiche importanti della apoptosi comprendono il rilevamento di danno al DNA con il saggio TUNEL, insieme con la rilevazione dell'attività della caspasi (rilevata con anticorpi monoclonali o una molecola legante come ZVAD-fmk), l'osservazione di cambiamenti cellulari, e la presentazione di fosfatidilserina (PS ) sulla superficie della membrana (rilevata da annessina V vincolante). Ci sono alcuni svantaggi con ciascuno di questi saggi. Per esempio, la transferasi terminale utilizzato nel saggio TUNEL non…

Materials

Name of the reagent	Company		Catalogue number
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	#L-7528
Hanks BSS	Invitrogen	14025-076
Paraformaldehyde	EMD	EM-PX0055-3
Vectashield	VECTOR	H-1200
DMEM	Cellgro	10-013-CV
Non-essential amino acids	Cellgro	25-025-CI
Sodium pyruvate	Cellgro	25-000-CI
FBS	Hyclone	SH30071.02
Pen-Strep	Invitrogen	15140-122
b-Mercaptoethanol, 50 mM	Invitrogen	21985-023
LabTek-II Chamber slides (8-well)	Nalge Nunc International	154534
0.1% Gelatin	Millipore	ES-006-B
Dulbecco’s PBS (D-PBS)	Cellgro	21-031-CV
			Solution Recipes 4% Paraformaldehyde For 100 ml: Mix 4 g paraformaldehyde, 90 ml H2O, and NaOH (a drop of 2N NaOH). The paraformaldehyde will not go into solution until you have added some NaOH to increase the pH. Stir and heat at 60 °C until all the powder is in solution (~10-20 min). Do not overheat. Add ~10 ml 10x PBS to achieve a final volume of 100 ml. Store at -20 °C in convenient (~10 ml or ~40 ml) aliquots. WARNING: Paraformaldehyde in ‘frill’ form (compressed small pellets) is less powdery and can therefore be measured outside of a hood. However you should still wear a protective dust mask (N95 at least) during handling. EB Culture Media For 500 ml EB Media: DMEM: 404.5 ml FBS: 75.0 ml L-Glutamine: 5.0 ml Penicillin/Streptomycin: 5.0 ml Non-essential amino acids: 5.0 ml Sodium pyruvate: 5.0 ml β-Mercaptoethanol: 500 μl