Uso de Lyso Tracker para detectar a morte celular programada em embriões e diferenciação das células-tronco embrionárias

Summary

Apresenta-se um protocolo simples de visualizar regiões de morte celular programada (PCD) em embriões de ratinho e de diferenciação estaminais embrionárias de culturas (ES) de células utilizando um corante altamente solúvel chamada Lyso Tracker.

Abstract

A morte celular programada (PCD) ocorre em adultos para manter a homeostase do tecido normal e durante o desenvolvimento embrionário de moldar os tecidos e órgãos ^1,2,6,7. Durante o desenvolvimento, produtos químicos tóxicos ou alterações genéticas podem causar um aumento na PCD ou mudar os padrões de PCD, resultando em anomalias do desenvolvimento e defeitos de nascimento ^3-5. Para compreender a etiologia de tais defeitos, o estudo de embriões podem ser complementados com os ensaios in vitro que utilizam diferenciação estaminais embrionárias (ES) células.

A apoptose é uma forma bem estudado de PCD que envolve tanto intrínsecos e extrínsecos de sinalização para ativar a enzima caspase cascata. Alterações celulares características incluem blebbing membrana, encolhimento nuclear, e fragmentação de DNA. Outras formas de PCD não envolvem a activação das caspases e pode ser o resultado final de autofagia prolongada. Independentemente da via de PCD, as células que morrem precisam de ser removidos. Em adultos, as células do sistema imunológico performe esta função, enquanto que em embriões, em que o sistema imune não desenvolveu ainda, a remoção ocorre por um mecanismo alternativo. Este mecanismo envolve as células vizinhas (chamados "não profissionais fagócitos") assumindo um papel-fagocítica eles reconhecem o 'me comer' sinal na superfície da célula a morrer e que engolem ^8-10. Após imersão, os detritos é trazido para o lisossoma pela degradação. Assim, independentemente do mecanismo de PCD, um aumento da actividade lisossomal pode ser correlacionada com o aumento da morte celular.

Para estudar PCD, um ensaio simples de visualizar lisossomas em tecidos espessos e culturas de multicamadas de diferenciação pode ser útil. Corante Lyso Tracker é uma molécula altamente solúvel pequeno que é retido na ácidas compartimentos subcelulares, tais como a ^11-13 lisossoma. O corante é absorvido por difusão e através da circulação. Uma vez que a penetração não é um obstáculo, visualização de CPD nos tecidos espessos e multi-camada de culturas é possível ^12,13 </sup>. Em contraste, TUNEL (Terminal desoxinucleotidilo transferase dUTP nick end rotulagem) análise ^14, está limitado a pequenas amostras, secções histológicas, e as culturas de monocamada, porque o processo requer a entrada / permeabilidade de uma transferase terminal.

Em contraste com o azul de anilina, que difunde e é dissolvido por solventes, Lyso Tracker Red DND-99 é corrigível, brilhante e estável. A coloração pode ser visualizado com microscopia de fluorescência confocal ou padrão em montagem integral ou seção usando aquosas ou base solvente meios de montagem ^12,13. Aqui descrevemos protocolos utilizando o corante de olhar para PCD no normal e Sonic Hedgehog embriões de camundongos nulos. Além disso, demonstramos análise de PCD em diferenciar as culturas de células ES e apresentar um método de quantificação simples. Em resumo, coloração Lyso Tracker pode ser um ótimo complemento para outros métodos de detecção de PCD.

Protocol

1. Coloração Lyso Tracker de embriões de camundongos Gerar embriões de ratos, colocando jovens (5-6 semanas de idade) fêmeas em gaiolas do parafuso prisioneiro do sexo masculino. Monitorar nas manhãs seguintes para o aparecimento de um rolhão vaginal indicando que o acasalamento ocorreu. Se a mulher está grávida, meio-dia em que dia é chamado de 0,5 dpc (dias coito post). O procedimento aqui apresentado é ideal para embriões 7-13 DPC. No dia embrionário de interesse, a eutanásia fêmea…

Discussion

Características importantes da apoptose incluem a detecção de danos no DNA, com o ensaio de TUNEL, juntamente com a detecção da actividade da caspase (detectada com mAbs ou uma molécula de ligação, tal como zVAD-fmk), a observação das modificações celulares, bem como a apresentação de fosfatidilserina (PS ) na superfície da membrana (detectado pela aderência à anexina V). Existem algumas desvantagens com cada um destes ensaios. Por exemplo, a transferase terminal utilizado no ensaio de TUNEL não penetr…

Materials

Name of the reagent	Company		Catalogue number
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	#L-7528
Hanks BSS	Invitrogen	14025-076
Paraformaldehyde	EMD	EM-PX0055-3
Vectashield	VECTOR	H-1200
DMEM	Cellgro	10-013-CV
Non-essential amino acids	Cellgro	25-025-CI
Sodium pyruvate	Cellgro	25-000-CI
FBS	Hyclone	SH30071.02
Pen-Strep	Invitrogen	15140-122
b-Mercaptoethanol, 50 mM	Invitrogen	21985-023
LabTek-II Chamber slides (8-well)	Nalge Nunc International	154534
0.1% Gelatin	Millipore	ES-006-B
Dulbecco’s PBS (D-PBS)	Cellgro	21-031-CV
			Solution Recipes 4% Paraformaldehyde For 100 ml: Mix 4 g paraformaldehyde, 90 ml H2O, and NaOH (a drop of 2N NaOH). The paraformaldehyde will not go into solution until you have added some NaOH to increase the pH. Stir and heat at 60 °C until all the powder is in solution (~10-20 min). Do not overheat. Add ~10 ml 10x PBS to achieve a final volume of 100 ml. Store at -20 °C in convenient (~10 ml or ~40 ml) aliquots. WARNING: Paraformaldehyde in ‘frill’ form (compressed small pellets) is less powdery and can therefore be measured outside of a hood. However you should still wear a protective dust mask (N95 at least) during handling. EB Culture Media For 500 ml EB Media: DMEM: 404.5 ml FBS: 75.0 ml L-Glutamine: 5.0 ml Penicillin/Streptomycin: 5.0 ml Non-essential amino acids: 5.0 ml Sodium pyruvate: 5.0 ml β-Mercaptoethanol: 500 μl