Användning av LysoTracker att upptäcka programmerad celldöd i embryon och Skilja embryonala stamceller

Summary

Vi presenterar ett enkelt protokoll för att visualisera områden programmerad celldöd (PCD) i musembryon och differentiera embryonala stamceller (ES) cellodlingar med en lättlöslig färg kallas LysoTracker.

Abstract

Programmerad celldöd (PCD) förekommer hos vuxna för att upprätthålla normal vävnad homeostas och under embryologiska utveckling att forma vävnader och organ ^1,2,6,7. Under utvecklingen kan giftiga kemikalier eller genetiska förändringar orsaka en ökning av PCD eller ändra PCD mönster resulterar i utvecklingsstörningar och fosterskador ^3-5. För att förstå etiologin av dessa defekter kan studiet av embryon kompletteras med in vitro-analyser som använder differentierande embryonala stamceller (ES-celler).

Apoptos är en väl studerad formen av PCD som involverar både inre och yttre signalering att aktivera kaspas enzymet kaskaden. Karakteristiska cellförändringar inkluderar membran blåsbildning, kärnkraft krympning och DNA-fragmentering. Andra former av PCD inte innebär kaspasaktivering och kan vara slutresultatet av långvarig autophagy. Oavsett PCD vägen, döende celler måste avlägsnas. Hos vuxna immuncellerna perfOrm denna funktion, medan embryon, där immunförsvaret ännu inte har utvecklat sker avlägsnandet av en alternativ mekanism. Denna mekanism innebär angränsande celler (kallas "icke-professionella fagocyter") tar på en fagocytisk roll-de känner igen den "äter mig"-signal på ytan av den döende cellen och uppsluka den ^8-10. Efter omvälvning är skräp förs till lysosom för nedbrytning. Sålunda oberoende av PCD mekanism, kan en ökning i lysosomal aktivitet korreleras med ökad celldöd.

För att studera PCD, en enkel analys för att visualisera lysosomer i tjocka vävnader och flerskiktade differentierande kulturer kan vara användbara. LysoTracker färgämnet är en lättlöslig liten molekyl som kvarhålles i sura subcellulära fack såsom lysosomen ^11-13. Färgämnet tas upp genom diffusion och genom cirkulationen. Eftersom penetrationen är inte ett hinder, visualisering av PCD i tjocka vävnader och flera lager kulturer är möjligt ^12,13 </sup>. Däremot är TUNEL (terminalt deoxinukleotidyltransferas dUTP nick slutet märkning) analys ^14, begränsad till små prover, histologiska sektioner och kulturer monolager eftersom förfarandet kräver inträde / permeabiliteten av en terminal transferas.

I motsats till Anilin blå, som diffunderar och löses av lösningsmedel, är LysoTracker Röd DND-99 fixerbar, ljusa och stabil. Färgning kan visualiseras med standard lysrör eller konfokalmikroskopi i hel-fäste eller avsnitt med vattenbaserade eller lösningsmedelsbaserade monteringsmedia ^12,13. Här beskriver vi protokoll som använder denna färg att titta på konsekvent politik för utveckling i normal och Sonic hedgehog null embryon mus. Dessutom visar vi analys av PCD att skilja kulturer ES cell och presentera en enkel kvantifiering metod. Sammanfattningsvis kan LysoTracker färgning vara ett bra komplement till andra metoder för att upptäcka PCD.

Protocol

1. LysoTracker Färgning av musembryon Generera musembryon genom att placera unga (5-6 veckor gamla) kvinnor i manliga stud burar. Övervaka följande morgon för uppkomsten av en vaginal plugg som indikerar att parning har skett. Om honan är gravid, är middagstid på dagen kallas 0,5 DPC (dagar efter samlag). Förfarandet som presenteras här är perfekt för embryon 7-13 DPC. Den embryonala dagen av intresse, avliva honan enligt godkända protokoll och ta bort livmodern. Ta bort embryon från de…

Discussion

Viktiga kännetecken för apoptos inkluderar detektion av DNA-skada med TUNEL-analysen, tillsammans med detekteringen av kaspas-aktivitet (detekterad med mAb eller en bindningsmolekyl såsom zVAD-fmk), observation av cellulära förändringar, och presentationen av fosfatidylserin (PS ) på membranytan (detekteras av Annexin V-bindning). Det finns vissa nackdelar med var och en av dessa analyser. Till exempel tränger terminalen transferas används i TUNEL-analysen inte utöver några cellager. Även Annexin V kan marke…

Materials

Name of the reagent	Company		Catalogue number
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	#L-7528
Hanks BSS	Invitrogen	14025-076
Paraformaldehyde	EMD	EM-PX0055-3
Vectashield	VECTOR	H-1200
DMEM	Cellgro	10-013-CV
Non-essential amino acids	Cellgro	25-025-CI
Sodium pyruvate	Cellgro	25-000-CI
FBS	Hyclone	SH30071.02
Pen-Strep	Invitrogen	15140-122
b-Mercaptoethanol, 50 mM	Invitrogen	21985-023
LabTek-II Chamber slides (8-well)	Nalge Nunc International	154534
0.1% Gelatin	Millipore	ES-006-B
Dulbecco’s PBS (D-PBS)	Cellgro	21-031-CV
			Solution Recipes 4% Paraformaldehyde For 100 ml: Mix 4 g paraformaldehyde, 90 ml H2O, and NaOH (a drop of 2N NaOH). The paraformaldehyde will not go into solution until you have added some NaOH to increase the pH. Stir and heat at 60 °C until all the powder is in solution (~10-20 min). Do not overheat. Add ~10 ml 10x PBS to achieve a final volume of 100 ml. Store at -20 °C in convenient (~10 ml or ~40 ml) aliquots. WARNING: Paraformaldehyde in ‘frill’ form (compressed small pellets) is less powdery and can therefore be measured outside of a hood. However you should still wear a protective dust mask (N95 at least) during handling. EB Culture Media For 500 ml EB Media: DMEM: 404.5 ml FBS: 75.0 ml L-Glutamine: 5.0 ml Penicillin/Streptomycin: 5.0 ml Non-essential amino acids: 5.0 ml Sodium pyruvate: 5.0 ml β-Mercaptoethanol: 500 μl