Visualizando bactérias em nematóides por microscopia de fluorescência

Summary

Para estudar o mutualismo entre<em> Xenorhabdus</em> Bactérias e<em> Steinernema</em> Nemátodos, foram desenvolvidos métodos para monitorizar a presença de bactérias e localização no interior de nemátodos. A abordagem experimental, a qual pode ser aplicada a outros sistemas, implica bactérias engenharia para expressar a proteína fluorescente verde e visualização, por meio de bactérias de microscopia de fluorescência dentro do nemátodo transparente.

Abstract

Simbioses, a convivência de dois ou mais organismos, são comuns em todos os reinos da vida. Como dois dos organismos mais ubíquos na Terra, nemátodos e bactérias formam uma grande variedade de associações simbióticas que vão desde benéfico para patogénico ^1-3. Uma associação como é o relacionamento mutuamente benéfico entre as bactérias e nematóides Steinernema Xenorhabdus, que emergiu como um sistema modelo de simbiose ^4. Nematóides entomopatogênicos Steinernema são, usando seu simbionte bacteriano para matar insetos ^5. Para a transmissão entre os hospedeiros de insetos, as bactérias colonizam o intestino do nematóide juvenil fase infecciosa ^6-8. Recentemente, várias outras espécies de nematóides foram mostrados para utilizar as bactérias para matar insectos ^9-13, e começaram investigações examinar as interacções entre os nemátodos e bactérias nestes sistemas <sup> 9.

Descreve-se um método para a visualização de um simbionte bacteriano dentro ou sobre um hospedeiro de nematóides, tirando partido da transparência óptica de nemátodos, quando vistas através de microscopia. As bactérias são manipuladas para expressar uma proteína fluorescente, permitindo a sua visualização por microscopia de fluorescência. Estão disponíveis muitos plasmídeos que transportam genes que codificam proteínas que fluorescem a diferentes comprimentos de onda (ou seja, verde ou vermelha), e de conjugação de plasmídeos a partir de uma estirpe de Escherichia coli doador em um receptor symbiont bacteriana é bem sucedida para uma ampla gama de bactérias. Os métodos descritos foram desenvolvidos para investigar a associação entre Steinernema carpocapsae e nematophila Xenorhabdus ^14. Métodos semelhantes têm sido utilizados para investigar outros nematóides bactéria associações de ^{9, 15-18} e, portanto, o método é geralmente aplicável.

O Method permite a caracterização da presença de bactérias e de localização dentro de nemátodos em diferentes fases de desenvolvimento, proporcionando insights sobre a natureza da associação e do processo de colonização ^{14, 16, 19.} A análise microscópica revela tanto a frequência dentro de uma população de colonização e localização de bactérias aos tecidos do hospedeiro ^{14, 16, 19-21.} Esta é uma vantagem sobre os outros métodos de monitorização de bactérias dentro das populações de nematóides, tais como a sonicação ou a trituração ^{22 23,} o qual pode fornecer níveis médios de colonização, mas não pode, por exemplo, discriminar populações com uma alta frequência de baixa carga simbióticas de populações com uma baixa freqüência de cargas simbióticas elevados. Discriminando a freqüência ea carga de bactérias colonizadoras pode ser especialmente importante quando a seleção ou caracterização de bactérias mutantes para os fenótipos de colonização ^{21, 24.} Com efeito, a microscopia de fluorescência tem sido utilizada na pesquisa de alto rendimento de mutantes bacterianos para defeitos de colonização ^{17, 18,} ​​e é menos trabalhosa do que outros métodos, incluindo a sonicação ^{22, 25-27} e dissecção de nemátodos individuais ^{28, 29.}

Protocol

1. Construção de uma estirpe bacteriana fluorescente via Conjugação Crescer a estirpe receptora (symbiont a ser examinada), e estirpe dadora durante a noite. A estirpe dadora, Escherichia coli, geralmente, deve ser capaz de doar DNA através de conjugação e deve ser transformada com uma. Plasmídeo (Tabela 2), que transporta um gene que codifica uma proteína fluorescente Dependendo do plasmídeo, de uma estirpe ajudante de conjugação também podem ser necessários. Se for as…

Discussion

O protocolo aqui descrito proporciona um método para a detecção óptica de bactérias dentro de um hospedeiro de nemátodos (Figura 1). Este método tira vantagem da transparência óptica dos nemátodos e a capacidade de bactérias fluorescentes de etiquetas, permitindo a análise in vivo das bactérias dentro do hospedeiro nematóide (Figura 3). Especificamente, esta abordagem identifica a localização de bactérias dentro de seu hospedeiro. Ao contar uma popula?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Lipid Agar (sterile)			8 grams nutrient broth, 15 grams agar, 5 grams yeast extract, 890 ml water, 10 ml 0.2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml corn syrup solution*, 4 ml corn oil* Stir media while pouring plates *add sterile ingredient after autoclaving
Corn Syrup Solution (sterile)			7 ml corn syrup, 89 ml water mix and autoclave
Egg Solution			16.6 ml 12% sodium hypochlorite, 5 ml 5M KOH, 80 ml water
Lysogeny Broth (sterile)			5 grams yeast extract, 10 grams tryptone, 5 grams salt, 1 L water mix and autoclave
Microfuge	Fisher	13-100-675	Any microfuge that holds microfuge tubes will work
Centrifuge	Beckman	366802	Large table top centrifuge that holds 15 ml and 50 ml conical tubes
Sterile 60 mm X 15 mm Petri Dish	Fisher	0875713
50 ml centrifuge tubes	Fisher	05-539-6
15 ml centrifuge tubes	Fisher	05-531-6
Sterile 100 mm X 20 mm Petri Dish	Fisher	0875711Z	Deeper than standard Petri dishes
24-well plate	Greiner Bio-One	662000-06
Microscope			The microscope needs florescent capabilities compatible with your fluorophore
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS (sterile)			8 g NaCL 0.2 g KCL 1.44 g Na2HPO4 0.24 g KH2PO4 1 L water Adjust to a pH of 7.4 and water to 1 L and autoclave
Microfuge tubes	Fisher	05-408-138	2 ml or 1.5 ml tubes
Shaker			Any shaker that causes the liquid to gently move will work
Diaminopimelic acid	Sigma	D-1377	If needed, supplement media to a concentration or 1 mM