Visualizzare batteri nei nematodi usando la microscopia a fluorescenza

Summary

Per studiare il mutualismo tra<em> Xenorhabdus</em> Batteri e<em> Steinernema</emNematodi>, i metodi sono stati sviluppati per monitorare la presenza di batteri e posizione all'interno nematodi. L'approccio sperimentale, che può essere applicata ad altri sistemi, comporta batteri ingegneria per esprimere la proteina fluorescente verde e visualizzazione, utilizzando batteri microscopia a fluorescenza all'interno del nematode trasparente.

Abstract

Simbiosi, la convivenza di due o più organismi, sono diffusi in tutti i regni della vita. Come due dei microrganismi più diffusi sulla terra, nematodi e batteri formano una vasta gamma di associazioni simbiotiche che vanno dal vantaggioso per patogeni ^1-3. Una tale associazione è il rapporto di reciproco beneficio tra i batteri e nematodi Xenorhabdus Steinernema, che è emerso come un sistema modello di simbiosi ^4. Nematodi Steinernema sono entomopatogeno, usando il loro simbionte batterico per uccidere gli insetti ^5. Per la trasmissione tra gli host di insetti, i batteri colonizzano l'intestino dello stadio infettivo del nematode del giovanile ^6-8. Recentemente, diverse specie di nematodi altri hanno dimostrato di utilizzare i batteri per uccidere insetti ^9-13, ed indagini hanno iniziato a esaminare le interazioni tra i nematodi e batteri in questi sistemi <sup> 9.

Si descrive un metodo per la visualizzazione di un simbionte batterico all'interno o su un host nematode, sfruttando la trasparenza ottica di nematodi quando visti al microscopio. I batteri sono progettati per esprimere una proteina fluorescente, consentendo loro visualizzazione mediante microscopia a fluorescenza. Sono disponibili molti plasmidi che portano geni che codificano proteine ​​che reagiscono a lunghezze d'onda differenti (verde o rossa), e la coniugazione dei plasmidi da un ceppo di Escherichia coli in un donatore simbionte destinatario batterica è successo per una vasta gamma di batteri. I metodi descritti sono stati sviluppati per indagare l'associazione tra Steinernema carpocapsae e Xenorhabdus nematophila ^14. Metodi simili sono stati utilizzati per studiare altri nematodi batterio associazioni ^{9, 15-18} e l'approccio è quindi generalmente applicabile.

La method consente la caratterizzazione della presenza di batteri e localizzazione all'interno nematodi a diversi stadi di sviluppo, fornendo approfondimenti sulla natura dell'associazione e il processo di colonizzazione ^{14, 16, 19.} Analisi microscopica rivela sia colonizzazione frequenza all'interno di una popolazione di batteri e localizzazione per ospitare tessuti ^{14, 16, 19-21.} Questo è un vantaggio rispetto ad altri metodi di monitoraggio batteri all'interno popolazioni di nematodi, come sonicazione ²² o molatura ^23, che possono fornire livelli medi di colonizzazione, ma non può, per esempio, discriminare popolazioni con una frequenza elevata di bassi carichi simbionti da popolazioni con una bassa frequenza di carichi elevati simbionti. La discriminazione della frequenza e del carico di batteri colonizzatori può essere particolarmente importante quando lo screening o la caratterizzazione di mutanti batterici fenotipi colonizzazione ^{21, 24.} Infatti, microscopia a fluorescenza è stato utilizzato in screening ad alta di mutanti batterici per difetti di colonizzazione ^{17, 18,} ​​ed è meno laborioso rispetto ad altri metodi, compreso sonicazione ^{22, 25-27} e dissezione nematode individuale ^{28, 29.}

Protocol

1. Costruzione di un ceppo batterico fluorescente via Coniugazione Crescere il ceppo ricevente (simbionte da esaminare) e ceppo donatore overnight. Il ceppo donatore, di solito Escherichia coli, dovrebbe essere in grado di donare DNA tramite coniugazione e devono essere trasformati con un plasmide (Tabella 2) che porta un gene codificante una proteina fluorescente. A seconda del plasmide, un ceppo helper coniugazione può anche essere richiesto. Se è così, questo ceppo deve anche e…

Discussion

Il protocollo qui descritto fornisce un metodo per la rilevazione ottica di batteri all'interno di un host nematode (Figura 1). Questo metodo sfrutta la trasparenza ottica di nematodi e la capacità di etichetta fluorescente batteri, consentendo l'analisi in vivo di batteri all'interno dell'ospite nematode (Figura 3). In particolare, questo approccio identifica localizzazione batterica all'interno del suo ospite. Contando una popolazione di nematodi e scorin…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Lipid Agar (sterile)			8 grams nutrient broth, 15 grams agar, 5 grams yeast extract, 890 ml water, 10 ml 0.2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml corn syrup solution*, 4 ml corn oil* Stir media while pouring plates *add sterile ingredient after autoclaving
Corn Syrup Solution (sterile)			7 ml corn syrup, 89 ml water mix and autoclave
Egg Solution			16.6 ml 12% sodium hypochlorite, 5 ml 5M KOH, 80 ml water
Lysogeny Broth (sterile)			5 grams yeast extract, 10 grams tryptone, 5 grams salt, 1 L water mix and autoclave
Microfuge	Fisher	13-100-675	Any microfuge that holds microfuge tubes will work
Centrifuge	Beckman	366802	Large table top centrifuge that holds 15 ml and 50 ml conical tubes
Sterile 60 mm X 15 mm Petri Dish	Fisher	0875713
50 ml centrifuge tubes	Fisher	05-539-6
15 ml centrifuge tubes	Fisher	05-531-6
Sterile 100 mm X 20 mm Petri Dish	Fisher	0875711Z	Deeper than standard Petri dishes
24-well plate	Greiner Bio-One	662000-06
Microscope			The microscope needs florescent capabilities compatible with your fluorophore
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS (sterile)			8 g NaCL 0.2 g KCL 1.44 g Na2HPO4 0.24 g KH2PO4 1 L water Adjust to a pH of 7.4 and water to 1 L and autoclave
Microfuge tubes	Fisher	05-408-138	2 ml or 1.5 ml tubes
Shaker			Any shaker that causes the liquid to gently move will work
Diaminopimelic acid	Sigma	D-1377	If needed, supplement media to a concentration or 1 mM