Visualisere Bakterier i Nematoder med fluorescerende Mikroskopi

Summary

Å studere mutualism mellom<em> Xenorhabdus</em> Bakterier og<em> Steinernema</em> Nematoder, metoder ble utviklet for å overvåke bakteriell tilstedeværelse og plassering i nematoder. Den eksperimentelle tilnærming, som kan brukes til andre systemer, innebærer tekniske bakterier å uttrykke grønt fluorescerende protein og visualisering, bruker fluorescensmikroskopi bakterier innenfor det gjennomsiktige nematode.

Abstract

Symbiose, den lever sammen av to eller flere organismer, er utbredt i alle riker av livet. Som to av de mest utbredte organismer på jorden, nematoder og bakterier danner et bredt utvalg av symbiotiske foreninger som spenner fra gunstig for sykdomsfremkallende ^1-3. En slik sammenheng er det gjensidig fordelaktig forhold mellom Xenorhabdus bakterier og Steinernema nematoder, som har dukket opp som et modellsystem for symbiose ^4. Steinernema nematoder er entomopathogenic, ved hjelp av sin bakteriell symbionten å drepe insekter ^5. For overføring mellom insekt verter, bakterier kolonisere tarmen av nematode er infeksiøs yngelstadiet ^6-8. Nylig har flere andre nematode arter blitt vist å utnytte bakterier for å drepe insekter ^9-13, og undersøkelser har begynt å undersøke interaksjonen mellom nematoder og bakterier i disse systemene <sup> 9.

Vi beskriver en fremgangsmåte for visualisering av en bakteriell symbionten innenfor eller på en nematode vert, å utnytte den optiske transparens av nematoder når sett ved mikroskopi. Bakteriene er konstruert for å uttrykke et fluorescerende protein, slik at deres visualisering av fluorescens mikroskopi. Mange plasmider er tilgjengelig som bærer gener som koder for proteiner som fluorescerer ved forskjellige bølgelengder (dvs. grønn eller rød), og konjugering av plasmider fra en donor Escherichia coli-stamme i en mottaker bakteriell symbionten er vellykket for et bredt spekter av bakterier. Metodene som er beskrevet ble utviklet for å undersøke sammenhengen mellom Steinernema carpocapsae og Xenorhabdus nematophila ^14. Liknende metoder har blitt brukt til å undersøke andre nematode-bakterien foreninger ^{9, 15-18} og tilnærming er derfor gjelder generelt.

The Method tillater karakterisering av bakteriell tilstedeværelse og lokalisering innenfor nematoder på ulike stadier av utviklingen, og gir innsikt i natur foreningen og prosessen med ^{14 kolonisering, 16, 19.} Mikroskopisk analyse avslører både kolonisering frekvens i en populasjon og lokalisering av bakterier som vert vev ^{14, 16, 19-21.} Dette er en fordel fremfor andre metoder for overvåking bakterier innenfor nematode populasjoner som sonikering ²² eller sliping ^23, som kan gi gjennomsnittlig nivå av kolonisering, men kan for eksempel ikke, diskriminere populasjoner med en høy frekvens av lavpris Symbiont laster fra populasjoner med en lav frekvens av høye Symbiont belastninger. Diskriminerende frekvens og belastning av koloniserende bakterier kan være spesielt viktig når screening eller karakterisere bakterielle mutanter for kolonisering fenotyper ^{21, 24.} Har faktisk fluorescensmikroskopi blitt brukt i høy gjennomstrømning screening av bakterielle mutanter med defekter i ^{17 kolonisering, 18,} ​​og er mindre arbeidskrevende enn andre metoder, inkludert sonikering ^{22, 25-27} og individuell nematode disseksjon ^{28, 29.}

Protocol

1. Bygging av en fluoriserende bakteriestammen via Bøyning Grow mottakeren stamme (symbionten skal undersøkes) og donor belastning over natten. Donor belastningen, vanligvis Escherichia coli, bør være i stand til å donere DNA gjennom konjugering og bør transformert med et plasmid (Tabell 2) som bærer et gen som koder for et fluorescerende protein. Avhengig plasmidet, kan en konjugering helper stamme også være nødvendig. I så fall bør denne belastningen også dyrkes over n…

Discussion

Protokollen beskrevet her gir en fremgangsmåte for optisk deteksjon av bakterier i en nematode vert (Figur 1). Denne metoden drar nytte av den optiske transparens av nematoder og evnen til fluorescently label bakterier, slik in vivo analyse av bakterier innenfor nematode verten (Figur 3). Konkret identifiserer denne tilnærmingen bakteriell lokalisering innenfor sin vert. Ved å telle en nematode befolkning og scoring for bakteriell tilstedeværelse, kan frekvensen av bakterie…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Lipid Agar (sterile)			8 grams nutrient broth, 15 grams agar, 5 grams yeast extract, 890 ml water, 10 ml 0.2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml corn syrup solution*, 4 ml corn oil* Stir media while pouring plates *add sterile ingredient after autoclaving
Corn Syrup Solution (sterile)			7 ml corn syrup, 89 ml water mix and autoclave
Egg Solution			16.6 ml 12% sodium hypochlorite, 5 ml 5M KOH, 80 ml water
Lysogeny Broth (sterile)			5 grams yeast extract, 10 grams tryptone, 5 grams salt, 1 L water mix and autoclave
Microfuge	Fisher	13-100-675	Any microfuge that holds microfuge tubes will work
Centrifuge	Beckman	366802	Large table top centrifuge that holds 15 ml and 50 ml conical tubes
Sterile 60 mm X 15 mm Petri Dish	Fisher	0875713
50 ml centrifuge tubes	Fisher	05-539-6
15 ml centrifuge tubes	Fisher	05-531-6
Sterile 100 mm X 20 mm Petri Dish	Fisher	0875711Z	Deeper than standard Petri dishes
24-well plate	Greiner Bio-One	662000-06
Microscope			The microscope needs florescent capabilities compatible with your fluorophore
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS (sterile)			8 g NaCL 0.2 g KCL 1.44 g Na2HPO4 0.24 g KH2PO4 1 L water Adjust to a pH of 7.4 and water to 1 L and autoclave
Microfuge tubes	Fisher	05-408-138	2 ml or 1.5 ml tubes
Shaker			Any shaker that causes the liquid to gently move will work
Diaminopimelic acid	Sigma	D-1377	If needed, supplement media to a concentration or 1 mM