Visualización de las bacterias en los nematodos mediante microscopía de fluorescencia

Summary

Para estudiar el mutualismo entre<em> Xenorhabdus</em> Bacterias y<em> Steinernema</emNematodos>, se han desarrollado métodos para monitorizar la presencia bacteriana y la ubicación dentro de los nematodos. El enfoque experimental, que se puede aplicar a otros sistemas, implica bacterias de ingeniería para expresar la proteína verde fluorescente y la visualización, utilizando bacterias de microscopía de fluorescencia dentro del nematodo transparente.

Abstract

Simbiosis, la convivencia de dos o más organismos, se han generalizado en todos los reinos de la vida. Como dos de los organismos más ubicuos en la tierra, nematodos y bacterias formar una amplia variedad de asociaciones simbióticas que van desde beneficioso para patógena ^1-3. Una de estas asociaciones es la relación de beneficio mutuo entre las bacterias y nematodos Steinernema Xenorhabdus, que ha surgido como un sistema modelo de simbiosis ^4. Nematodos entomopatógenos Steinernema son, con su simbionte bacteriano para matar insectos ^5. Para la transmisión entre huéspedes de insectos, las bacterias colonizan el intestino de la etapa del nemátodo infectivo juvenil ^6-8. Recientemente, varias otras especies de nematodos se ha demostrado que las bacterias utilizan para matar insectos ^9-13, y las investigaciones han comenzado a examinar las interacciones entre los nematodos y bacterias en estos sistemas <sup> 9.

Se describe un método para la visualización de un simbionte bacteriano dentro de o en un host nematodo, tomando ventaja de la transparencia óptica de los nematodos cuando se vieron por microscopía. Las bacterias se han diseñado para expresar una proteína fluorescente, lo que permite su visualización por microscopía de fluorescencia. Se dispone de muchos plásmidos que llevan los genes que codifican proteínas que presentan fluorescencia a longitudes de onda diferentes (es decir, verde o rojo), y la conjugación de los plásmidos procedentes de una cepa de Escherichia coli donante en un receptor simbionte bacteriano tiene éxito para una amplia gama de bacterias. Los métodos descritos se han desarrollado para investigar la asociación entre Steinernema carpocapsae y Xenorhabdus nematophila ^14. Métodos similares se han utilizado para investigar otros bacteria nematodos asociaciones ^{9, 15-18} y por lo tanto, el enfoque es en general aplicable.

El METhod permite la caracterización de la presencia bacteriana y la localización dentro de los nematodos en diferentes etapas de desarrollo, y proporciona información sobre la naturaleza de la asociación y el proceso de colonización ^{14, 16, 19.} El análisis microscópico revela tanto la frecuencia de colonización dentro de una población y la localización de las bacterias a los tejidos del huésped ^{14, 16, 19-21.} Esto es una ventaja sobre otros métodos de seguimiento de las bacterias dentro de las poblaciones de nematodos, tales como sonicación ²² o molienda ^23, que puede proporcionar los niveles medios de la colonización, pero no puede, por ejemplo, discriminar poblaciones con una alta frecuencia de bajas cargas simbiontes de poblaciones con una baja frecuencia de las cargas simbiontes altas. La discriminación de la frecuencia y de la carga de bacterias colonizadoras puede ser especialmente importante en el cribado o la caracterización de mutantes bacterianos para fenotipos colonización ^{21, 24.} En efecto, la microscopía de fluorescencia se ha utilizado en el cribado de alto rendimiento de mutantes bacterianos de los defectos de colonización ^{17, 18,} ​​y es menos laborioso que otros métodos, incluyendo la sonicación ^{22, 25-27} y disección nematodos individuales ^{28, 29.}

Protocol

1. Construcción de una cepa bacteriana fluorescente mediante conjugación Crece la cepa receptora (simbionte para ser examinadas) y la cepa donante durante la noche. La cepa donante, generalmente Escherichia coli, debe ser capaz de donar ADN a través de la conjugación y deben transformarse con un. Plásmido (Tabla 2) que lleva un gen que codifica una proteína fluorescente Dependiendo del plásmido, una cepa auxiliar conjugación también puede ser necesaria. Si es así, esta cepa…

Discussion

El protocolo aquí descrito proporciona un método para la detección óptica de las bacterias dentro de un huésped nematodo (Figura 1). Este método tiene la ventaja de la transparencia óptica de los nematodos y la capacidad de las bacterias de etiquetas fluorescentemente, lo que permite el análisis in vivo de las bacterias dentro del huésped nemátodo (Figura 3). En concreto, este enfoque identifica la localización de bacterias dentro de su huésped. Al contar u…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Lipid Agar (sterile)			8 grams nutrient broth, 15 grams agar, 5 grams yeast extract, 890 ml water, 10 ml 0.2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml corn syrup solution*, 4 ml corn oil* Stir media while pouring plates *add sterile ingredient after autoclaving
Corn Syrup Solution (sterile)			7 ml corn syrup, 89 ml water mix and autoclave
Egg Solution			16.6 ml 12% sodium hypochlorite, 5 ml 5M KOH, 80 ml water
Lysogeny Broth (sterile)			5 grams yeast extract, 10 grams tryptone, 5 grams salt, 1 L water mix and autoclave
Microfuge	Fisher	13-100-675	Any microfuge that holds microfuge tubes will work
Centrifuge	Beckman	366802	Large table top centrifuge that holds 15 ml and 50 ml conical tubes
Sterile 60 mm X 15 mm Petri Dish	Fisher	0875713
50 ml centrifuge tubes	Fisher	05-539-6
15 ml centrifuge tubes	Fisher	05-531-6
Sterile 100 mm X 20 mm Petri Dish	Fisher	0875711Z	Deeper than standard Petri dishes
24-well plate	Greiner Bio-One	662000-06
Microscope			The microscope needs florescent capabilities compatible with your fluorophore
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS (sterile)			8 g NaCL 0.2 g KCL 1.44 g Na2HPO4 0.24 g KH2PO4 1 L water Adjust to a pH of 7.4 and water to 1 L and autoclave
Microfuge tubes	Fisher	05-408-138	2 ml or 1.5 ml tubes
Shaker			Any shaker that causes the liquid to gently move will work
Diaminopimelic acid	Sigma	D-1377	If needed, supplement media to a concentration or 1 mM