Floresan Mikroskobu kullanılarak Nematodlar Bakteriler görselleştirme
Summary
Arasındaki karşılıkçılık incelenmesi<em> Xenorhabdus</em> Bakteri ve<em> Steinernema</em> Nematodlar, yöntemler bakteri varlığı ve nematod içindeki konumunu izlemek için geliştirilmiştir. Diğer sistemlere de uygulanabilir deneysel yaklaşım, mühendislik bakteri saydam nematod içinde floresan mikroskobu kullanarak, bakteri, yeşil floresan protein ve görselleştirme ile ifade gerektirir.
Abstract
Symbioses, iki veya daha fazla organizmaların birlikte yaşama, yaşamın tüm krallıkları boyunca yaygındır. Dünyanın en her yerde organizmaların iki olarak, nematod ve bakteri bu aralıktaki faydalıdır 1-3 patojenik simbiyotik dernekleri geniş bir dizi oluşturur. Böyle bir dernek Xenorhabdus bakteri ve sembiyoz 4 bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır Steinernema nematodlar arasındaki karşılıklı ilişkinin olduğunu. Steinernema nematod böcekler 5 öldürmek için onların bakteriyel symbiont kullanarak, entomopatojen vardır. Böcek bilgisayarlar arasında iletimi için, bakteri nematod en infektif juvenil evre 6-8 bağırsak kolonize. Son zamanlarda, birkaç diğer nematod türlerinin böcekler 9-13 öldürmek bakteri kullanmak gösterilmiştir ve araştırmalar bu sistemlerde nematodlar ve bakteriler arasındaki etkileşimleri inceleyerek başladık <> 9 sup.
Biz mikroskobu ile izlendi nematodların optik şeffaflık yararlanarak, içinde veya bir nematod konak üzerindeki bir bakteriyel symbiont görselleştirme için bir yöntem açıklanmaktadır. Bakteriler floresan mikroskobu kendi görselleştirme sağlayan bir floresan proteini ifade için tasarlanmıştır. Birçok plazmidler farklı dalga boyları (yani yeşil veya kırmızı) ve bir alıcı bakteri symbiont içine bir bağış Escherichia coli suşundan plazmidlerin konjugasyon az floresan proteinleri kodlayan genlerin bakterilerin geniş bir yelpazede için başarılı taşıdıkları mevcuttur. Açıklanan yöntemler Steinernema carpocapsae ve Xenorhabdus nematophila 14 arasındaki ilişkiyi araştırmak amacıyla geliştirilmiştir. Benzer yöntemler diğer nematod-bakteri dernekler 9, 15-18 araştırmak için kullanılan ve yaklaşım bu nedenle genellikle uygulanabilir edilmiştir.
Method dernek ve kolonizasyon 14, 16, 19 sürecinin doğasını içgörü sağlayarak, farklı gelişim aşamalarında nematodlar içinde bakteriyel varlığı ve lokalizasyonu karakterizasyonu sağlar. Mikroskopik analiz dokular 14, 16, 19-21 barındırmak için bir bakteri nüfusu ve yerelleştirme içinde kolonizasyon sıklığı açısından ortaya koymaktadır. Bu, örneğin sonikasyon 22 veya kolonizasyon ortalama seviyesi sağlayabilir 23, öğütme gibi nematod popülasyonlarının içinde bakteri izlenmesi başka yöntemlere göre büyük bir avantaj, fakat, örneğin, popülasyonlarından düşük symbiont yüklerinin bir yüksek frekans ile popülasyonlar ayırt olmayabilir Yüksek symbiont yükleri düşük frekans. Kolonizasyon fenotipleri 21 bakteriyel mutantların tarama veya karakterize ederken frekans ve kolonize bakteri yükü farklılaştırması özellikle önemli olabilir, 24. Gerçekten de, floresan mikroskobu kolonizasyon, 17, 18 kusurlar için bakteriyel mutant yüksek verimli tarama teknikleri kullanılmaktadır ve sonikasyon 22, 25-27 ve bireysel nematod disseksiyon 28, 29 de dahil olmak üzere diğer yöntemler, daha az zahmetli bir iştir edilmiştir.
Protocol
Discussion
Burada açıklanan protokol bir evsahibi nematodu (Şekil 1) içinde bakteri optik tespit için bir yöntem sağlar. Bu yöntem, nematod konak (Şekil 3) içinde bakteri in vivo analizi sağlayan, nematod optik şeffaflık ve floresan etiket bakterilerin yeteneği yararlanır. Özellikle, bu yaklaşım onun konak içinde bakteriyel yerelleştirme tanımlar. Bakteriyel varlığı için bir nematod popülasyonu ve puanlama sayarak, nematod popülasyonu üzerinde bakteri kolonizas…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar kullanılan bu protokol ve araçları geliştirme katkıları için Eugenio Vivas, Kurt Heungens, Eric Martens, Charles Cowles, Darby Şeker, Eric Stabb, ve Todd Ciche teşekkür etmek istiyorum. KEM ve JMC Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Ulusal Araştırma Hizmet Ödülü T32 (AI55397 "Sağlık ve Hastalık mikrop") tarafından desteklenmiştir. JMC Ulusal Bilim Vakfı (NSF) Lisansüstü Araştırma Bursu ile desteklenmiştir. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (IOS-0920631 ve IOS-0950873) hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Lipid Agar (sterile) |
8 grams nutrient broth, 15 grams agar, 5 grams yeast extract, 890 ml water, 10 ml 0.2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml corn syrup solution*, 4 ml corn oil* Stir media while pouring plates *add sterile ingredient after autoclaving |
||
| Corn Syrup Solution (sterile) |
7 ml corn syrup, 89 ml water mix and autoclave |
||
| Egg Solution | 16.6 ml 12% sodium hypochlorite, 5 ml 5M KOH, 80 ml water | ||
| Lysogeny Broth (sterile) |
5 grams yeast extract, 10 grams tryptone, 5 grams salt, 1 L water mix and autoclave |
||
| Microfuge | Fisher | 13-100-675 | Any microfuge that holds microfuge tubes will work |
| Centrifuge | Beckman | 366802 | Large table top centrifuge that holds 15 ml and 50 ml conical tubes |
| Sterile 60 mm X 15 mm Petri Dish | Fisher | 0875713 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher | 05-539-6 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Fisher | 05-531-6 | |
| Sterile 100 mm X 20 mm Petri Dish | Fisher | 0875711Z | Deeper than standard Petri dishes |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662000-06 | |
| Microscope | The microscope needs florescent capabilities compatible with your fluorophore | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PBS (sterile) |
8 g NaCL 0.2 g KCL 1.44 g Na2HPO4 0.24 g KH2PO4 1 L water Adjust to a pH of 7.4 and water to 1 L and autoclave |
||
| Microfuge tubes | Fisher | 05-408-138 | 2 ml or 1.5 ml tubes |
| Shaker | Any shaker that causes the liquid to gently move will work | ||
| Diaminopimelic acid | Sigma | D-1377 | If needed, supplement media to a concentration or 1 mM |
Referências
- Holterman, M., van der Wurff, A. Phylum-wide analysis of SSU rDNA reveals deep phylogenetic relationships among nematodes and accelerated evolution toward crown clades. Mol. Biol. Evol. 23, 1792-1800 (2006).
- Lambshead, P. J. D., Boucher, G. Marine nematode deep-sea biodiversity – hyperdiverse or hype. J. Biogeogr. 30, 475-485 (2003).
- Poinar, G. O. J., Thomas, G. M. Significance of Achromobacter nematophilus Poinar and Thomas (Achromobacteraceae: Eubacteriales) in the development of the nematode, DD-136 (Neoaplectana sp. Steinernematidae). Parasitol. 56, 385-390 (1966).
- Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).
- Kaya, H. K., Gaugler, R. Entomopathogenic nematodes. Annu. Rev. Entomol. 38, 181-206 (1993).
- Bird, A. F., Akhurst, R. J. The nature of the intestinal vesicle in nematodes of the family Steinernematidae. Int. J. Parasitol. 13, 599-606 (1983).
- Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. The Steinernema carpocapsae intestinal vesicle contains a subcellular structure with which Xenorhabdus nematophila associates during colonization initiation. Cell. Microbiol. 7, 1723-1735 (2005).
- Snyder, H. A., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. New insights into the colonization and release process of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae. Appl. Environ. Microbiol. 73, 5338-5346 (2007).
- Abebe, E., Abebe-Akele, F., Morrison, J., Cooper, V., Thomas, W. K. An insect pathogenic symbiosis between a Caenorhabditis and Serratia. Virulence. 2, 158-161 (2011).
- Abebe, E., Jumba, M. An entomopathogenic Caenorhabditis briggsae. J. Exp. Biol. 213, 3223-3229 (2010).
- Torres-Barragan, A., Suazo, A., Buhler, W. G., Cardoza, Y. J. Studies on the entomopathogenicity and bacterial associates of the nematode Oscheius carolinensis. Biol. Control. 59, 123-129 (2011).
- Ye, W. M., Torres-Barragan, A., Cardoza, Y. Oscheius carolinensis n. sp (Nematoda: Rhabditidae), a potential entomopathogenic nematode from vermicompost. Nematology. 12, 121-135 (2010).
- Zhang, C., Liu, J. Heterorhabditidoides chongmingensis gen. nov., sp. nov. (Rhabditida: Rhabditidae), a novel member of the entomopathogenic nematodes. J. Invertebr. Pathol. 98, 153-168 (2008).
- Martens, E. C., Heungens, K., Goodrich-Blair, H. Early colonization events in the mutualistic association between Steinernema carpocapsae nematodes and Xenorhabdus nematophila bacteria. J. Bacteriol. 185, 3147-3154 (2003).
- Ciche, T. A., Ensign, J. C. For the insect pathogen, Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).
- Ciche, T. A., Kim, K. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Nguyen, K. C., Hall, D. H. Cell invasion and matricide during Photorhabdus luminescens transmission by Heterorhabditis bacteriophora nematodes. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2275-2287 (2008).
- Easom, C. A., Joyce, S. A., Clarke, D. J. Identification of genes involved in the mutualistic colonization of the nematode Heterorhabditis bacteriophora by the bacterium Photorhabdus luminescens. BMC Microbiol. 10, 45 (2010).
- Somvanshi, V. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Kim, K. S., Mallon, S., Ciche, T. A. Photorhabdus phase variants express a novel fimbrial locus, mad, essential for symbiosis. Mol. Microbiol. 77, 1021-1038 (2010).
- Martens, E. C., Russell, F. M., Goodrich-Blair, H. Analysis of Xenorhabdus nematophila metabolic mutants yields insight into stages of Steinernema carpocapsae nematode intestinal colonization. Mol. Microbiol. 51, 28-45 (2005).
- Sugar, D. R., Murfin, K. E. Phenotypic variation and host interactions of Xenorhabdus bovienii SS-2004, the entomopathogenic symbiont of Steinernema jollieti nematodes. Env. Microbiol. 14, 924-939 (2012).
- Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. The Xenorhabdus nematophila nilABC genes confer the ability of Xenorhabdus spp. to colonize Steinernema carpocapsae nematodes. J. Bacteriol. 190, 4121-4128 (2008).
- Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes. Mol. Microbiol. 45, 1337-1353 (2002).
- Goetsch, M., Owen, H., Goldman, B., Forst, S. Analysis of the PixA inclusion body protein of Xenorhabdus nematophila. J. Bacteriol. 188, 2706-2710 (2006).
- Bhasin, A., Chaston, J. M., Goodrich-Blair, H. Mutational Analyses Reveal Overall Topology and Functional Regions of NilB, a Bacterial Outer Membrane Protein Required for Host Association in a Model of Animal-Microbe Mutualism. J. Bacteriol. 194, 1763-1776 (2012).
- Ciche, T. A., Goffredi, S. K., Reddy, C. A. . Methods in General and Molecular Microbiology. , 394-419 (2007).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D., Grewal, P. S., Ciche, T. A., Stock, S. P., Boemare, N., Vandenberg, J., Glazar, I. . Insect Pathogens, Molecular Approaches and Techniques. , 239-269 (2009).
- Stock, S. P., Goodrich-Blair, H., Lacey, L. A. . Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , 375-425 (2012).
- Martens, E. C., Gawronski-Salerno, J. Xenorhabdus nematophila requires an intact iscRSUA-hscBA-fdx locus to colonize Steinernema carpocapsae nematodes. J. Bacteriol. 185, 3678-3682 (2003).
- Vivas, E. I., Goodrich-Blair, H. Xenorhabdus nematophilus as a model for host-bacterium interactions: rpoS is necessary for mutualism with nematodes. J. Bacteriol. 183, 4687-4693 (2001).
- White, G. F. A method for obtaining infective nematode larvae from cultures. Science. 66, 302-303 (1927).
- Ciche, T. A., Ensign, J. C. For the insect pathogen Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).
- Sicard, M., Brun, N. L. e. Effect of native Xenorhabdus on the fitness of their Steinernema hosts: contrasting types of interaction. Parasitol. Res. 91, 520-524 (2003).
- Lambertsen, L., Sternberg, C., Molin, S. Mini-Tn7 transposons for site-specific tagging of bacteria with fluorescent proteins. Environ. Microbiol. 6, 726-732 (2004).
- Miller, W. G., Leveau, J. H., Lindow, S. E. Improved gfp and inaZ broad-host-range promoter-probe vectors. Mol. Plant Microbe Int. 13, 1243-1250 (2000).
- Teal, T. K., Lies, D. P., Wold, B. J., Newman, D. K. Spatiometabolic stratification of Shewanella oneidensis biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 72, 7324-7330 (2006).
- Bao, Y., Lies, D. P., Fu, H., Roberts, G. P. An improved Tn7-based system for the single-copy insertion of cloned genes into chromosomes of Gram-negative bacteria. Gene. 109, 167-168 (1991).
- Woodring, J. L., Kaya, H. K. Steinernematid and Heterorhabditid Nematodes: A Handbook of Biology and Techniques. Southern Cooperative Series Bulletin 331. , (1988).
