Monitoring Plasmide Replicatie in Live zoogdiercellen over meerdere generaties door fluorescentie microscopie
Summary
Werkwijze voor het observeren individuele DNA-moleculen in levende cellen beschreven. De techniek is gebaseerd op de binding van een fluorescent gelabeld lac repressor eiwit bindingsplaatsen ontworpen in het DNA van belang. Deze methode kan worden aangepast aan vele recombinant DNA volgen in levende cellen in de tijd.
Abstract
Weinig natuurlijk voorkomende plasmiden worden gehandhaafd in zoogdiercellen. Onder deze zijn genomen van gamma-herpesvirussen, zoals Epstein-Barr virus (EBV) en Kaposi-sarcoom-geassocieerd herpesvirus (KSHV) die leiden tot meerdere menselijke maligniteiten 1-3. Deze twee genomen worden gerepliceerd in een erkende wijze elk een unieke virale eiwitten en cellulaire replicatie machines, en worden doorgegeven aan dochtercellen bij celdeling ondanks hun waar traditionele centromeren 4-8.
Er is veel werk gedaan om de replicatie van deze plasmide genomen karakteriseren methoden zoals Southern blotting en fluorescentie in situ hybridisatie (FISH). Deze methoden zijn beperkt, alhoewel. Kwantitatieve PCR en Southern blots informatie over het gemiddelde aantal plasmiden per cel in een populatie van cellen. FISH is een single-cell assay dat zowel het gemiddelde aantal en de verdeling van plasmide onthult s per cel in de populatie van cellen, maar statisch, zodat geen informatie over de ouder of nakomelingen van de onderzochte cel.
We beschrijven een werkwijze voor het visualiseren van plasmiden in levende cellen. Deze methode is gebaseerd op de binding van een fluorescent gelabeld lactose repressor eiwit naar meerdere locaties in het plasmide plaats 9. Het DNA van belang is ontworpen om ongeveer 250 tandem repeats van de lactose operator (LACO) sequentie omvatten. LACO is specifiek gebonden door de lactose repressor eiwit (LacI), die kan worden gefuseerd aan een fluorescerend eiwit. Het fusie-eiwit kan tot expressie worden gebracht van de kunstmatige plasmide zijn of van een retrovirale vector. Op deze wijze worden de DNA moleculen fluorescent gelabeld en daardoor zichtbaar via fluorescentiemicroscopie. Het fusie-eiwit wordt geblokkeerd binden van plasmide DNA door het kweken van cellen in aanwezigheid van IPTG tot de plasmiden kan worden bekeken.
NHOUD "> dit systeem kan de plasmiden worden bewaakt in levende cellen heen zijn de eigenschappen onthullen hun synthese en partitionering dochtercellen. Ideal hechtende cellen, getransfecteerd eenvoudig en hebben grote kernen. Deze techniek is gebruikt om te bepalen of 84% van EBV afgeleide plasmiden worden gesynthetiseerd elke generatie en 88% van de nieuw gesynthetiseerde plasmiden partitie getrouw aan dochtercellen in HeLa cellen. paren van deze EBV plasmiden werden gezien worden gebonden aan of verbonden met zusterchromatiden na hun synthese in S- fase totdat ze werden beschouwd te scheiden als zusterchromatiden gescheiden Anaphase 10. methode wordt momenteel gebruikt om replicatie van KSHV genomen in HeLa cellen en SLK cellen te bestuderen. HeLa cellen geïmmortaliseerde menselijke epitheelcellen en SLK cellen geïmmortaliseerde humane endotheliale cellen. Hoewel SLK-cellen werden oorspronkelijk afkomstig van een KSHV laesie, noch de HeLa noch SLK cellijn natuurlijk harbors KSHV genomen 11. Naast het bestuderen van virale replicatie kan deze visualisatie techniek worden toegepast om de effecten van de toevoeging, verwijdering of wijziging van verschillende DNA sequentie-elementen op synthese, lokalisatie en partitioneren van andere recombinant plasmide DNA te onderzoeken.Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven werkwijze kan worden gebruikt om plasmiden in levende zoogdiercellen tijd volgen over meerdere generaties. Door de beperking van de blootstelling aan excitatielicht, hebben we gebruik gemaakt van deze technieken om cellen van nieuw verdeeld paren volgen via kolonies van 16-32 cellen, die ten minste 72 uur en 3 celdelingen. Deze experimenten geven informatie niet kan worden verkregen door statische assays zoals kwantitatieve PCR, Southern blotting en FISH.
Het is essentieel…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de NIH en ACS, met inbegrip van T32CA009135, CA133027, CA070723 en CA022443. Bill Sugden is een American Cancer Society Research Professor.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM | GIBCO | 11965 | |
| OptiMEM | GIBCO | 31985 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Hygromycin | Calbiochem | 400050 | 400 μg/ml for SLK; 300 μg/ml for HeLa |
| Isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) | Roche | 10 724 815 001 | Final concentration 200 μg/ml |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| HEPES | GIBCO | 15630 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| CultFoil | Pecon | 000000-1116-08 | |
| Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Colibri | Zeiss | 423052-9500-000 | |
| Neutral white LED | Zeiss | 423052-9120-000 | |
| Filter Cube 75 HE | Zeiss | 489075-0000-000 | |
| Plan-Apochromat 63x/1.4 objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| CascadeII:1024 EMCCD camera | Photometrics | B10C892007 | |
| Tempcontrol mini | Zeiss/Pecon | 000000-1116-070 | |
| Tempcontrol 37-2 digital | Zeiss/Pecon | 000000-1052-320 | |
| CTI Controller 3700 digital | Zeiss/Pecon | 411856-9903 | |
| Objective heater | Zeiss/Pecon | 440760-0000-000 | |
| Stage heating insert P | Zeiss/Pecon | 411861-9901-000 | |
| Stage-top Incubator S | Zeiss/Pecon | 411860-9902-000 | |
| Humidifier System | Zeiss/Pecon | 000000-1116-065 |
Referências
- Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).
- Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi’s sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
- Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. . Fields Virology 2 volume set. , (2006).
- Adams, A. Replication of latent Epstein-Barr virus genomes in Raji cells. J. Virol. 61, 1743-1746 (1987).
- Humme, S., et al. The EBV nuclear antigen 1 (EBNA1) enhances B cell immortalization several thousandfold. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10989-10994 (1073).
- Verma, S. C., Choudhuri, T., Robertson, E. S. The minimal replicator element of the Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus terminal repeat supports replication in a semiconservative and cell-cycle-dependent manner. J. Virol. 81, 3402-3413 (2007).
- Yates, J. L., Guan, N. Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells. J. Virol. 65, 483-488 (1991).
- Ye, F. C., et al. Disruption of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence. J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).
- Robinett, C. C., et al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. J. Cell Biol. 135, 1685-1700 (1996).
- Nanbo, A., Sugden, A., Sugden, B. The coupling of synthesis and partitioning of EBV’s plasmid replicon is revealed in live cells. Embo. J. 26, 4252-4262 (2007).
- Herndier, B. G., et al. Characterization of a human Kaposi’s sarcoma cell line that induces angiogenic tumors in animals. Aids. 8, 575-581 (1994).
- Zhou, F. C., et al. Efficient infection by a recombinant Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis. J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Pawley, J. B., Pawley, J. B. Points, pixels, and gray levels: digitizing image data. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 59-79 (2006).
- Cannell, M. B., McMorland, A., Soeller, C., Pawley, J. B. Image enhancement by deconvolution. Handbook of biological confocal microscopy. , 488-500 (2006).
