Trombosit-aracılı kesekleşme için Basit Protokolü<em> Plasmodium falciparum</emBir kaynak Poor Setting> ile enfekte Eritrosit

Summary

Bu yöntem, Platelet dolayımlı topaklanma fenotip inceler<em> Plasmodium falciparum</emKlinik izolatlarında> ile enfekte eritrositler (pRBC). Bu, trombosit açısından zengin plazma ve pRBC bir süspansiyonu izole edilmesi ve co-kuluçkaya yatırarak gerçekleştirilir.

Abstract

Plasmodium falciparum sıtma enfeksiyonu ciddi bir çoğunluğu neden olur. Serebral sıtma (CM) altında yatan patofizyolojik mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır ve çeşitli hipotezler P. tarafından mikrodamarlar mekanik tıkanıklığı da dahil olmak üzere, öne sürülmüştür falciparum-parazitlenmiş kırmızı kan hücreleri (pRBC). Gerçekten de, yaşam döngüsünün içi eritrositik aşamasında, S. falciparum RBC membran üzerine yapışkan özellikleri değişen yüzey antijenleri ihraç ederek enfekte eritrosit yüzeyine değiştirmek için eşsiz bir yeteneği vardır. Bu post-kapiller venüllerde ¹ mikrovasküler astar endotel hücrelerine yapışma birden fazla doku ve organlarda pRBC ihtiyati haciz sağlar. Böyle yaparak, parazitin olgun formları deforme enfekte eritrositlerin dalak boşluğu önlemek ² ve daha uygun bir düşük oksijen basıncı ³ çevreleri kısıtlamak. Bu SEQUEST bir sonucu olarakrasyon, sadece olgunlaşmamış aseksüel parazitleri ve periferik kan tespit edilebilir gametocytes olduğunu.

Mikrovasküler yatak üzerinde ifade çok sayıda ev sahibi reseptörlerine olgun pRBC bir Cytoadherence ve haciz şiddetli ve komplike olmayan hastalık ortaya çıkar. Ancak, kanıt birkaç satır sadece belirli yapışkan fenotipleri sıtma ciddi patolojik sonuçlar ile ilişkili olması muhtemel olduğunu göstermektedir. Bu tür özel ana parazit etkileşimleri bir örneği, belirli bir yapışma özelliklerine sahip pRBC bağlayıcı desteklemek için hücreler arası yapışma molekülü-1 kabiliyeti ^4,5 serebral malarya gelişimi ile bağlantılı olmuştur in vitro olarak gösterilmiştir. Plasenta da chondrotin sülfat ile, sıtma ile enfekte gebe kadınlarda tercihli pRBC birikimi bir site olarak kabul edilmiştir bir sinsityotrofoblastlarda üzerinde ifade bu hat ana reseptör ⁶ olarak plasental intervillöz alanı. PRBC t rozetlenmesitamamlayıcı reseptör 1 (CD35) ^7,8 ile o bulaşmamış eritrosit de ağır hastalık ⁹ ile ilişkilendirilmiştir.

En son anlatılan S. biri falciparum'un cytoadherence fenotipleri in vitro trombosit aracılı topaklar oluşturmak için pRBC kabiliyetidir. Bu tür pRBC kümeleri oluşumu CD36, trombosit yüzeyinde ifade edilen bir glikoprotein gerektirir. Endotel hücreleri ve trombositler de dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinde ifade başka bir insan reseptörü gC1qR/HABP1/p32, aynı zamanda kümeleri ¹⁰ oluşturmak için trombositler üzerinde pRBC yapışmasını kolaylaştırmak için gösterilmiştir. In vivo olarak oluşur topaklanma belirsizliğini koruyor, ancak CM ¹¹ öldü Malavili çocukların beyin mikrovasküler açıklanan trombositlerin önemli birikimi için sorumlu olabilir olsun. Buna ek olarak, klinik yeteneği in vitro olarak gelme kültürleri izole doğrudan Malawi'li ¹² hastalığın şiddeti ile bağlantılıydı </sup> Ve Mozambik hasta ^13, (olmasa da Malili ^14).

Kötü karakterize pRBC topaklanma fenotip çeşitli yönleri ile, bu konuda mevcut çalışmalar standart bir prosedür takip değil. Bunun nedeni tahlil ¹⁵ doğasında bilinen yüksek değişkenliğin önemli bir konudur. Burada, P. in vitro trombosit aracılı clumping için bir yöntem sunar diğer gruplar için tutarlı bir yöntem için bir platform sağlamak ve gelecekteki çalışmalarda bu fenotip soruşturmada sınırlamalar konusunda bilinçlendirilmesi umuyor ile falciparum. Malavi merkezli olmak, biz yeni toplanmış klinik izolatları dondurulması için gerek kalmadan fenotip için incelenebilir avantajı ile, özellikle sınırlı bir kaynak ayarı için tasarlanmış bir protokol sağlar.

Protocol

1. Örnek Toplama Trombositler kolayca sıcaklık, ajitasyon veya depolama ile aktif hale getirilebilir ve bu yüzden dikkatle ele alınmalıdır. Trombosit hazırlanması için kan toplamak için vacutainers, bir çok klinik durumlarda kaçınılmazdır, ama emme potansiyel olarak trombosit aktivasyonu neden olabilir dikkatle düşünülmelidir. Araştırma hastanede kullanılan klinik protokol, bizim örnekleri dikkatle sodyum sitrat vacutainers toplanır. Bu ya da önceki çalışmada 12 erken trombosit aktivasyonu ile herhangi bir sorun yaşamamış. Biz spesifik olmayan kan grubu antijen toplama en aza indirmek için kan grubu O + kişilerden trombosit hazırlanması için kan toplamak. Bağış ayrıca bazı ilaçlar trombosit fonksiyonu etkilediği bilinmektedir bir önceki 7-10 gün içinde ilaç almamış. Trombosit açısından zengin plazma 1.1 hazırlanması (PRP) Yaklaşık 5 ml arasındaCM veya ağır sıtma (SM) bir sodyum sitrat Vacutainer hasta (BD ürün numarası 36276) bir sıtma saf bir ana ya da kan 2.5 ml tam kan. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 250 x g'de santrifüj tam kan. Düşük sıcaklıklarda agrega için trombositlerin neden olabilir ° C 4 de santrifüj yok. Dikkatlice temiz bir 15 ml tüp bulutlu süpernatant aktarın. Trombositler kolayca sıcaklık değişimleri ve fiziksel darbelere tarafından aktive edilir ve bu nedenle dikkatle ele alınmalıdır. Sallayarak veya tüp herhangi bir ani kalkış yapmayın. > 300 trombosit süspansiyonu saymak ve ayarlamak için bir Neubauer en haematocytometer kullanarak x 10 3 trombosit / sağlıklı donörlerden için ul ve <150 x 10 3 trombosit / CM ve 1X fosfat tampon (pH 7.2-7.4; PBS) kullanılarak SM hastaların ul. Trombosit sayısı kolaylığı ve doğruluğunu sağlamak için yüksek seyreltme faktörü seçtiğinizden emin olun. Not: Sıtma patients sağlıklı bireyler 16,17,18 ile karşılaştırıldığında daha düşük bir trombosit sayısı vardır. CM ve UM Bu nedenle trombosit konsantrasyonları her sıtma tanı grubu içinde hastalar için ortalama trombosit sayısına göre ayarlanır. S. falciparum topaklanma fenotip CM izole yaygındır ve trombosit konsantrasyonu tüm CM durumlar için standart olduğu için küme boyutu veya sıklığı etkilemez güçlü bir bağlanma afinitesi bu nedenle düşük trombosit konsantrasyonları görüntüler. Trombosit bakımından yoksul plazma, 1.2 hazırlanması (PPP) PPP elde etmek için, 10 dakika boyunca 1500 x g'de Yukarıda elde edilen PRP bir bölümü santrifüj. Trombosit çoğunluğu tüpün altındaki pellet haline getirilir. PRP ve PPP ikisi de iki haftaya kadar 4 ° C'de muhafaza edilebilir. İdeal olarak, topaklanma tahlil için taze trombosit kullanın. 8-10 gün sonra trombosit en aktif ve muhtemelen toplu olması muhtemeldir. 2. Parasite Kültür 5 dakika boyunca 370 x g'de santrifüj ile 5-10 ml RPMI 1640 pelet pRBC üç kez yıkayın. Not: bu protokoldeki tüm kültürlerde yaklaşık 1 ml dolu hücre hacmi (PCV) başladı ve 5% hematokrit tutulur. Kültürler pRBC herhangi PCV ile başladı ve istenilen hematokrit ulaşmak için bulaşmamış RBC ve medya ile buna göre ayarlanabilir. 25 mM HEPES,% 5 Albumax II ya da% 10 serum ve 40 ug /% 5 hematokrit elde etmek ml gentamisin ile takviye edilmiş RPMI 1640 sıtma standart kültür ortamı ile bir kültür şişesi ve ek olarak pRBC yerleştirin. Mühürleme ve inkübasyondan önce,% 92.5 azot,% 2.5 oksijen ve% 5 karbon dioksit karışımı ile kültür şişeleri nüfuz. Alternatif olarak, Trager-Jensen hava geçirmez bir mum kavanozu yöntem kullanılabilir. PRBC hastalar doğrudan elde için, olgun parazitleri almak için% 5 CO 2 bir 37 ° C inkübatör 24-36 saat kendi kültürü şişesi kuluçkaya yatmaktadır. NOT: Most laboratuar ve kültür adapte hatları standart koşullar altında kültür bakımı çok kolaydır. Büyüme oranını korumak için farklı parazit aşamaları senkronize etmek için kullanılabilecek aşağıda tarif edildiği basit bir teknik vardır. Aşağıda açıklandığı gibi ince bir kan yayma hazırlayın ve bir ışık mikroskobu altında parazit olgunlaşma inceleyin. 3. İnce Kan Film Slayt Hazırlama Düz bir yüzeye oturan bir buzlu cam slayt bir ucunda kan yaklaşık 10-15 ul yerleştirin. Kan eşit ikinci slayt kenarına yayılmış kadar ikinci bir slayt kenarı ile kan damla dokunun. Ilk slayt üzerinde çok fazla baskı uygulamadan, hızlı fakat nazikçe, açısı 45 ° de ikinci slayt tutarken, eşit yayılır kan ince bir film yapmak için ilk slayt boyunca kan kaydırın. Hava kuru. 10 saniye metanol içinde slayt batırın. Hava kuru. 2% Giemsa st slayt DipEn az 10 dakika boyunca Ain. Su temiz çalışır kadar yoğun durulayın. Hava kuru. Bir ışık mikroskobu üzerinde 90-100x yağ emülsiyonu lens kullanarak slayt inceleyin 4. Aseksüel Aşamaları saflaştırılması ve Senkronizasyon Olgun P. arıtma falciparum pRBC topaklanma testi için gerekli bir adımdır. Gerçekten de, sadece olgun parazitler ilgili ligandları ifade edilen ve enfekte olan eritrositlerin yüzeyinden çıkıntı vardır, bu yaşam döngüsü aşamada olduğu gibi trombosit reseptörlerine bağlanma yeteneğine sahiptir. P. eşeysiz aşamaları arındırmak ve senkronize etmek için çeşitli yöntemler vardır falciparum: Geç eşeysiz aşamalarında Percoll degrade 19 ile zenginleştirilmiş olabilir; 20 sıralama veya jelatin sedimantasyon 21 protokolünü kullanarak manyetik hücre burada açıklanan.. Sorbitol-senkronizasyon (hiçbir n halkaları olgun aşamalarında elde etmek için 24-26 saat kültüre sonra, halka aşamaları 22 için seçer) jelatin yüzdürme gerçekleştirmek için eed. 4.1 Plasmagel Flotasyon Plasmagel flotasyon yoğun halka formları ve rozet dibine çöker ise daha düşük ağırlık çözüm kalmasını eritrositler knobbed seçmek için jelatin benzeri çözüm kullanır. Bu teknik, olgun bir sahne-enfekte olan eritrositlerin% 90 saflıkta kadar verir ve alan ve laboratuar izolatlarının her ikisi için de kullanılabilir. Bununla birlikte, daha önce belirtildiği gibi, yüzdürme plasmagel rozetleme pRBC yanı sıra, yüksek frekanslı rozetleme ile bu örneklerde daha düşük bir topaklanma frekans neden immatür aşamalarını ortadan kaldırır. Topaklanma trombositler tarafından nakline bağlama aracılı ise rozetlenmesini pRBC ve enfekte olmayan eritrositlerin bir etkileşim olduğundan, ancak, plasmagel flotasyon sonra rozetleme pRBC yokluğunda topaklanma testi etkilemez. Bu iki özellikleri dahil ligand farklıdır; özellikle rozetlenmesini aracılık bulaşmamış eritrositler üzerinde reseptör CR-1 tamamlayacak ile. ° C bir su banyosunda 37 ön ısıtılması Gelofusine çözeltisi ve serum / Albumax II içermeyen aracı. 5 dakika boyunca 370 x g'de oda sıcaklığında santrifüj ile temiz bir steril 15 ml tüp ve pelet hücreleri kültürü aktarın. Süpernatan dikkatle aspire şekilde Gelofusine ve proteinsiz ortamda bir eşit hacmi içinde pelet ve süspansiyon hücreleri bozmamaya. Steril bir 15 ml tüp karışımı aktarın ve net bir sınır bir üst ve alt düzeyi arasında görülebilir kadar 37 ° C inkübatör 15-20 dakika veya bekletin. Dikkatlice yeni bir steril 15 ml tüp üst katman aktarmak ve taze RPMI 10 ml ekleyin. 5 dakika boyunca 370 x g santrifüj ve dikkatle supernatant atın. Ince kan smear ile parasitaemia ve gelişimsel aşamada değerlendirmek ve bölüm 4 açıklandığı gibi bir ışık mikroskobu altında inceleyin. NOT: enfekte eritrosit dependi 60-90% arasında Olgun pRBC aralığıkültürünün ilk parasitaemia üzerinde ng. Olgun parazitler yüksek oranda için, ≥ 10% bir başlangıç ​​parasitaemia ile kültürler kullanın. 5. Testi topaklanma 1 plasmagel yüzdürme sonra elde pRBC süspansiyon saymak ve ayarlamak için bir Neubauer en haematocytometer kullanın x 10 8 ul / pRBC. Yeni bir 1.5 ml'lik bir tüp içinde, 20 mg / toplam hacminin% 10 ml son konsantrasyon ile PRP% 5 hematokrit, akridin de tekrar süspansiyon pRBC. Bunun yerine akridin portakal, parazit kültürleri kullanımdan önce 5 dakika boyunca 25 mg / ml etidyum bromür ile boyanmış olabilir. 200 ul reaksiyon karışımı örneğin, 10 ul olgun pRBC, 300 x 10 3 trombosit / sağlıklı donörler ya da 150 x 10 3 trombosit / SM hastaların ul ve proteinsiz ortamda 170 ul ikinci PRP ul 20 ul ekle. NOT: trombosit oranı: pRBC son reaksiyonlar olarak 20:1 olduğunu. Maxim izin verir gibi bu önemlidirum bir numunenin topaklanma frekansı tespit edilmesi. Daha az trombosit kontrollerde eklenirse o zaman tüm topaklanma nakline gelme şansına sahip olabilir değil. Nakline topaklanma trombositlerin rolünü tespit etmek için enfekte olmamış kırmızı kan hücreleri ve PRP ve PPP ile pRBC, aynı şekilde aşağıdaki kontrolleri hazırlamak. Bir 1.5-2.0 ml konik vidalı kapaklı flakon süspansiyonu aktarın. Oda sıcaklığında 10-12 rpm'de haddeleme ile nazik çalkalama altında şişe yerleştirin. Bir bardak kayma ve floresan altında incelemek ile kaplayın, pRBC 10 ul pipetleme tarafından hazırlanan ıslak-slayt ± bir cam slayt trombosit karışımı ile küme oluşumu olup olmadığını kontrol edin. Numune 120 dakikalık bir toplam 15-20 dakika aralıklarla yapılabilir. Bir yığın üç veya daha fazla enfekte eritrositlerin bir toplam olarak kabul edilir.

Representative Results

Yaklaşık% 70 P. olgun aşamaları kullanarak bir Platelet dolayımlı yığın testi için bir örnek plasmagel flotasyon ile zenginleştirmeden sonra falciparum, Şekil 2 'de gösterilmiştir. Bir yığın üç veya daha fazla enfekte eritrositlerin bir toplamıdır. Akridin turuncu veya etidyum bromür ile boyanarak floresan mikroskobu ile görüntülenmiştir olabilir. Etidyum bromür kırmızı 493 nm bir uyarma maksimum ve rodamin boyalar benzer 620 nm emisyon maksimum (, sahipken akridin turuncu, 502 nm dalga boyunda bir uyarım maksimum ve 525 nm (yeşil) bir emisyon maksimum, floresein için spektral benzer .) Bu noktalar gibi hücre yığınlar olarak ve floresan altında görünür ışık altında, normal olarak Kümelenmeye kolayca mikroskop altında tespit edilir, Şekil 2'de gösterildiği gibi (sırasıyla akridin turuncu ve etidyum bromid boyalarla boyanmış zaman yeşil ve kırmızı akridin oranj kullanılarak 30 dakika zaman noktasında .) Kümeleri büyük, daha büyük hücre agrega un görünürder normal ışık ve yeşil ya da kırmızı altındaki en noktalar büyük ilgili boyalar için floresan. Boyalar hedef DNA ve bu nedenle leke çekirdekleri, trombosit ve bulaşmamış RBC çekirdeklerin onların eksikliği nedeniyle floresan mikroskop altında tespit olmadığından. 4.7 küçük pRBC kümeleri Rastgele oluşumu ± 1.6 nakline / yığın 30 dakika sonra ortaya çıkar. Yığın boyutunu önemli ölçüde çok sayıda pRBC / görsel sayılır olamazdı yığın içeren bazı kümeleri ile 120 dakika inkübasyondan sonra> 15 pRBC / kümeleri bir ortalama artırır. Enfekte hücre sayısı çift tahlillerinde sayılır yığıntı / 1,000 enfekte olmuş hücrelerde mevcut gibi topaklanma fenotip sıklığı hesaplanır. Şekil 1. Deneme topaklanma için iş akışı. Trombosit rICH ve fakir plazma (A) ve S. falciparum ile enfekte eritrosit kültürü (B) topaklanma testi (C) hazırlanmış ve daha sonra birleştirilir. Şekil 2. P. ile enfekte eritrositlerin topaklanma falciparum laboratuvar izole. 0 zamanında HB3 oluşturduğu kümeleri, 30 ve 120 trombosit açısından zengin plazma dakika (A) ve trombosit kötü plazma (B) kötü küme oluşumu. Testi Sınırlamalar Özellikle trombosit fonksiyonu ya da sonucu etkiler etkiler ve bunların çoğu zaten Arman ve Rowe 15 vurgulanmıştır sınırlamalar vardır. Burada differe de karşılaşılabilecek olası sorunları bazı sözTestin nt aşamaları: In vitro kültür klinik izolatlar adapte bazen uzun kültür süreleri topaklar oluşmasına izin vermek için yeteri kadar yüksek parasitaemia elde etmek için gerekli olan bir sorun olabilir. P. yüksek antijenik değişim oranları falciparum, kültür-adapte parazitin yapışkan fenotip kültüründe uzun zaman sonra orijinal bulaşmasını parazit nüfusun yansıtmıyor olabilir. Kan grubu antijenleri bağlı olarak spesifik olmayan aglütinasyon önlemek için, trombosit vericisi aynı tahlilde kullanılan klinik izolatları veya evrensel verici kanı antijen grubu O-el ile kan grubu antijeni ile uyumlu olmalıdır. Ancak, kan grubu bireyler gibi Malavi gibi Afrika sitelerinde nadir O-ve bu nedenle yaygın olarak kullanılan trombosit kan grubu O + vericilerden elde edilen ve kan grubu için uyumlu olmak zorunda. Islak bir slayt hazırlanması kümeleri sayma c olarak görüntü yakalama için hantal ve zorluarşın sürekli hareket halindeler. Genellikle, pRBC kapak kayma kenarlarında birikir ya da kolayca gerçek kümeleri ile karışabilir "yanlış" kümeleri oluşturan birbirine yapışma eğilimi gösterirler. Hücre hareketini azaltmak için, analizden önce oda sıcaklığında 15 dakika süreyle sedimente hücreleri sağlar. Topaklanma testi zaman duyarlıdır ve bu nedenle sadece bir örnek en iyi doğruluk için her seferinde kişi başına analiz edilmesini sağlar. Iki farklı örnek için zaman örnekleme noktalarının kolayca aynı anda birden fazla numune taşıma eğer örnekleri arasında uyumsuz örnekleme zaman noktalarında çıkan, çakışabilir. Bu gibi durumlarda, sofistike yazılım kantitatif yığın boyutlarını hesaplamak olabilir ya da alternatif olarak hücre-spesifik antikorlar kümeleri bileşimini analiz etmek için kullanılabilir. Bu testte kullanılması muhtemel olduğu bu teknikleri büyük ölçüde kaynak kötü ortamlarda, verilerin önemini artırmak olsa da, bu tür teknikler ve ekipman hazır değildir.

Discussion

Biz doğrudan alanında klinik izolatlarının pRBC incelemek için kullanılan bir Platelet dolayımlı topaklanma testi tanımlamışlardır. Platelet dolayımlı topaklanma, S., karakteristik bir davranış falciparum'un klinik izolat, CD36 bağlayıcı izole ^12,23-24 sık ayrı bir yapıştırıcı fenotipi olarak tespit edilmiştir. 1) P. in vitro topaklanma fenotip güçlü: Biz üç ana noktaları belirlemek için bu testte kullanmış falciparum hastalık şiddeti ve tanı 2) CD36, 3 ile birlikte trombositler üzerinde topaklanma yeni reseptör P-selektin mediaties) CM hastalarda mevcut trombositopeni derecesi ile ilişkilidir Malavili çocuk izole içinde pRBC kümeleri daha da oluşumunu sınırlamak için yeterlidir in vitro ^12. Topak oluşumu trombositlerin katılımı bölüm 6'da tarif edildiği gibi bir ıslak-preparat hazırlama incelenerek gösterilmiştir. Trombositler yüksek hızda santrifüj ile TZP izole edilebilirkan grubu antijenik reaksiyonları en aza indirmek amacıyla, bununla birlikte, aşırı kullanımdan kaynaklanan ve yüksek hızlı santrifüj ile erken trombosit aktivasyonu en aza indirmek amacıyla bütün PRP kullanılır. Trombosit aktivitesi zayıf trombosit agonistleri, epinefrin veya ^{26'da belirtildiği gibi,} adenosin difosfat (ADP) ²⁵ kullanılarak platelet agregasyonu testi ile ölçülebilir.

Daha önce zayıf bir şekilde karakterize edilmiştir, tahlilin çeşitli yönleri, PRP kaynakları ve deney sonucunu kan antijen gruplarının etkisi seçiminin önemini bunlardan biri bulunmaktadır. Biz kan grubu O olan bireylerden PRP hazırlanan + ve bazı ilaç trombosit davranışını etkileyebilir gibi kan çizilir önceki son 7-10 gün içinde herhangi bir ilaç almamıştı.

Başarı topaklanma etkileyebilecek diğer faktörler pRBC hematokrit, parasitaemia düzeyleri ve topaklanma testinin süresini içerir. Yüksek hematokrit ve trombosit ortak kullanılmasıbu küme gerçekten bir yığın olan ya da yoğun ¹⁵ dolu olduğu için olmadığını çok fazla hücre sadece birlikte oturan olup olmadığını söylemek zor olacaktır unt. Topaklanma da genellikle uzun inkübasyon süreleri ile artar. Bu topaklanma çalışmalar tasarlarken dikkat edilmesi gereken tüm yararlı kurallar vardır.

Farklı klinik gruplarından örnekler bunu yapmak mümkün olup olmadığını paralel aynı donörden TZP kullanarak analiz edilebilir, ancak bu alanda siteleri gibi sınırlı kaynak ayarları transfüzyonu havuzu genellikle sınırlı olduğunu bulmak. Bu tahliller standardize etmek için tek bir O + verici olması zordur. Bu nedenle mümkün olan her yerde kan grubu uyumluluğu sağlamak için çeşitli O + bağış tespit. Kan bağışı bu yükü sadece bir bireysel girmemektedir birden çok donör kullanılması da büyük örnekleri boyutlarda durumlarda yararlıdır.

Tek bir pe ise 15-20 dk Örnekleme noktaları çok daha mümkün olanrson ıslak-slayt hazırlıkları için izin ve üst üste örnekleme süreleri olmaksızın tahlil kinetik performans, deneyleri yürütüyor. Mikroskobik verilerin çoğu görsel ve biraz amacı, bu nedenle, hücre sayımı bir fazla kişi tarafından doğrulanır önemlidir. Bu durumda, her seferinde bir numune işleme kişisel etkinliğine bağlı olarak 3-4 numune bir gün arasında tam bir analiz izin verebilir.

Platelet dolayımlı topaklanma klinik ve laboratuar izolat her ikisini de kullanarak gerçekleştirilebilir. Laboratuvar hatları için, CD36 bağlama parazit topaklanma frekansları en üst düzeye çıkarmak için kullanılır önerilir. Tahlil, örneğin rozetleme veya pRBC bağlayıcı, bu fenotip bir anlaşılamamıştır ve incelenen yönü aracılık edebilir, trombositlerin reseptörlerinin çalışma sağlayacak inhibisyon deneyleri topaklanma olarak kullanılan diğer aglütinasyon deneyleri ile akuple edilebilir.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
RPMI 1640	Invitrogen	21870-092
Acridine orange	Invitrogen	A3568	10 mg/ml
Gelofusine	B Braun	Gelofusine
1 M HEPES	Invitrogen	15630
Gentamycin	Invitrogen	15750045	50 mg/ml
Albumax	GIBCO	1102-037
Sodium citrate vacutainer	BD	362760	4 ml capacity
Inverted Microscope	Leica	MD16000 B
Fluorescent microscope	Leica	EL6000	Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide