Utilizzo di RNA-mediata strategia di alimentazione di interferenza secondo schermo per geni coinvolti nella regolazione Dimensione del corpo nel nematode<em> C. elegans</em
Summary
Abbiamo dimostrato come utilizzare la tecnica di alimentazione RNAi per abbattere i geni bersaglio e corpo fenotipo punteggio dimensione in<em> C. elegans</em>. Questo metodo può essere utilizzato per uno schermo grande scala per identificare potenziali componenti genetiche di interesse, come quelli coinvolti nella regolazione dimensioni del corpo tramite segnalazione DBL-1/TGF-β.
Abstract
Doppio filamento di RNA-mediata interferenza (RNAi) è una strategia efficace per abbattere l'espressione del gene bersaglio 1-3. Esso è stato applicato a sistemi modello molti tra piante, invertebrati e vertebrati. Ci sono vari metodi per raggiungere RNAi in vivo 4,5. Ad esempio, il gene bersaglio può essere trasformato in un vettore RNAi, e quindi permanentemente o transitoriamente trasformati in linee cellulari o cellule primarie per ottenere effetti atterramento gene; alternativamente sintetizzati oligonucleotidi a doppio filamento da geni specifici (oligo RNAi) può essere transitoriamente trasformati in linee cellulari o cellule primarie per mettere a tacere i geni bersaglio, o di sintesi del doppio filamento molecole di RNA possono essere microiniettato in un organismo. Poiché il nematode C. elegans utilizza batteri come fonte di cibo, nutrire gli animali con i batteri che esprime a doppio filamento di RNA contro geni bersaglio fornisce una strategia sostenibile 6. Qui vi presentiamo una alimentazione RNAimetodo per segnare dimensioni fenotipo corpo. Taglia corpo in C. elegans è regolato principalmente dal TGF-β – come ligando DBL-1, quindi questo saggio è appropriato per l'identificazione dei componenti di segnalazione TGF-β 7. Abbiamo usato diversi ceppi tra due ceppi ipersensibili RNAi per ripetere gli esperimenti di alimentazione RNAi. I nostri risultati hanno dimostrato che RRF-3 ceppo ci ha dato il miglior fenotipo atteso RNAi. Il metodo è di facile esecuzione, riproducibile e facilmente quantificato. Inoltre, il nostro protocollo minimizza l'uso di attrezzature specializzate, quindi è adatto per piccoli laboratori o quelli a istituzioni prevalentemente universitari.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, si descrive il nostro metodo per l'identificazione di mutanti difettosi delle dimensioni del corpo C. elegans di alimentazione RNAi. Questo metodo è applicabile alla identificazione di TGF-β componenti segnalazione. Dal momento che tali componenti sono altamente conservati nel corso dell'evoluzione 15 schermi che abbiano una connessione a chiarire i meccanismi molecolari di TGF-β segnalazione in tutti i metazoi. Una considerazione importante nel progettare tale scherm…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo James Clark per la fornitura di figure di animali in vari momenti dello sviluppo. C. ceppi elegans in questo studio sono stati ottenuti dalla Genetics Caenorhabditis Center, che è supportato dal National Center for NIH Research (NCRR). Questo lavoro è stato sostenuto da CIRG 1817 della CUNY a JL e CSD, e dal NIH 1R15GM073678-01 e 1R15GM097692-01 al CSD Ringraziamo il Dott. William J. Rice, il dottor Nathalia Holtzman, e Melissa Silvestrini per i commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato svolto in adempimento parziale dei requisiti per un dottorato di ricerca del Graduate Center della City University di New York (S. Xiong).
Materials
| RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |
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