Summary
Fare beyninden alınan F1FO ATP sentetaz kompleksleri zenginleştirilmiş submitochondrial veziküller izole etmek için bir yöntem tarif edilmektedir. Bu veziküller F1FO ATPaz karmaşık yama kelepçe kayıt tekniği kullanarak modülasyon aktivitesi çalışma sağlar.
Abstract
Mitokondri metabolizma, hayatta kalma 1, geliştirme ve, kalsiyum 2 sinyalizasyon dahil olmak üzere birçok önemli hücresel fonksiyonları olarak katılıyor. En önemli mitokondriyal fonksiyon iki ATP, oksidatif fosforilasyon ile hücrenin enerji birimi, ve programlanmış hücre ölümü 3 için sinyallerin arabuluculuk verimli üretimi ile ilgilidir.
ATP üretimi için öncelikle sorumlu enzim aynı zamanda ATP sentetaz 4-5 adı F1FO-ATP sentetaz vardır. Son yıllarda, apoptotik ve nekrotik hücre ölümü mitokondri rolünü oldukça dikkat çekmiştir. Apoptotik hücre ölümü, böyle Bax gibi BCL-2 ailesi proteinleri, mitokondriyal dış membran girin oligomerleşip ve sitoplazmada 6 içine pro-apoptotik faktör serbest, dış membran geçirgenliği. Klasik nekrotik hücre ölümü, böyle nöronlarda iskemi veya eksitotoksisite, bir larg tarafından üretilen bu kadarmatris kalsiyum e, kötü düzenlenmiş artış bir iç membran gözenek, mitokondriyal geçirgenlik gözenek veya mPTP açılmasına katkıda bulunur. Bu iç zarı depolarize ve dış membran rüptürü, pro-apoptotik faktörlerin serbest bırakılması ve metabolik fonksiyon bozukluğu katkıda, ozmotik vardiya neden olur. Bcl-xL 7 de dahil olmak üzere birçok protein F1FO ATP sentaz, modüle işlevi ile etkileşim. Bcl-xL F1FO ATP sentaz beta alt birimi ile doğrudan etkileşim ve bu etkileşimin F1FO ATPaz aktivitesi 8 sırasında F1FO tarafından H + net taşıma ve böylece artan mitokondriyal verimliliğin artırılması, F1FOATPasecomplex içinde sızıntı iletkenlik azalır. ATP sintaz aktivitesi ve modülasyon incelemek için, F1FO ATPaz içeren kemirgen beynindeki submitochondrial veziküller (SMVS) izole edilmiştir. Alavian ark gösterildiği gibi SMVS F1FO ATPaz'ın yapısal ve işlevsel bütünlüğünü korumak. Burada, bir yöntem tarifsıçan beyin SMVS en izolasyonu için başarılı bir şekilde kullanmış ve biz SMVS bir (iyon kaçak iletkenlik) kanal aktivitesini analiz etmek için yama kelepçe tekniği tasvir olduğunu.
Protocol
1. Beyin Mitokondriyal İzolasyon (Kahverengi MR ve ark uyarlanmıştır. 9)
- Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (IACUC) tarafından onaylanmış yöntemler kullanarak sıçan Kurban.
- Dekapitasyon hayvanın baş kesme, deri kesme ve kafatası maruz kalmaktadır.
- Bir makas veya rongeur ile keserek hafifçe kafatası açın. Beyin çıkarın.
- İzolasyon Tampon beyincik (bkz. Tablo 1) olmadan ince beyin kıyma ve 5 ml cam / teflon homojenizatör (donanım listesini görmek) aktarın.
- Doku hafifçe 10 kez (hava kabarcığı), yaklaşık 5 dakika homojenize.
- 4 10 dakika ° C bir tezgah üstü santrifüj için 1500 × g örnek santrifüj.
- Süpernatant kaydedin (mitokondriyal ve sinaptozomlarda) ve pelet (nükleer malzeme ve hücre artıkları) atın. Bir tezgah üstü santrifüj 4 ° C'de 10 dakika 16.000 × g santrifüj.
- Iskartasüpernatan ve yeniden askıya İzolasyon Tampon 500 ul pelet. Bir hücre parçalama gemi (donanım listesini görmek) ile sinaptozomlarda bozabilir. Hızlı bir dekompresyon takiben 10 dakika boyunca 1,200 psi'lik bir basınç uygulanır.
- 126.500 de Katman Ficoll geçişlerini üzerine karışımı (bkz. Tablo 2), GB-50.1 rotor ve santrifüj yer × g 4 az 20 dakika ° bir ultrasantrifüjdeki C (donanım listesine bakınız). Topak, saflaştırılmış mitokondri olan, Ficoll farklı yoğunlukları arasındaki katman undisrupted sinaptozomlarda olup.
- 16.000 de İzolasyon Tampon santrifüj × g 4 10 dakika ° C için bir tezgah üstü santrifüj pelet yıkayın.
2. Submitochondrial Veziküller (SMV) İzolasyon (Chan ve ark. 10 uyarlanmıştır)
- % 1 digitonin bir eşit hacmi ile birleştirilmiş 200 ul izolasyon Tamponu içinde yeniden askıya mitokondri ve 15 dakika boyunca buz üzerinde bekletin.
- Daha İzolasyon Buff ekle16.000 de er ve santrifüj × 4 10 dakika g ° bir tezgah üstü santrifüj C. Iki kez yapın.
- 200 ul İzolasyon Tampon pelet yeniden askıya ve 10% Lubrol PX (C12E9) 2 ul ekleyin. Karıştırın ve 15 dakika boyunca buz üzerinde bekletin.
- 182.000 de İzolasyon Tampon, GB-50.1 rotor yer ve santrifüj üzerine Katman karışım × 4 de g ° 1 saat C.
- 4 ° C'de 10 dakika 16.000 de izolasyonu Tampon bir masa üstü santrifüj × g santrifüj son pelet yıkayın
3. Elektrofizyolojik Kayıt
- Tipik bir elektrofizyoloji teçhizat bir amplifikatör, pClamp10.0 yazılım, manipülatörler, bir mikroskop, bir titreşim izolasyonu tablo, Faraday Kafesi ile birlikte bir Digidata 1440A analog-dijital dönüştürücü arayüzü ile donatılmış bir PC bilgisayar içerir.
- Borosilikat cam kapiller tüplerin bir Flaming / Brown Mikropipet Çektirme Model P-87 eklenir. Bir pipet-çektirmenin programı için optimize edilmiştirMQ 80 ila 100 arasında dirençleri ile pipetler oluşturmak.
- SMVS fizyolojik bir hücre içi çözelti (ATP kayıt sırasında uygun bir zamanda ilave edilir) (Tablo 3) yerleştirilir. Yama kelepçe pipetler aynı çözeltisi (ATP yok) ile doldurulur. Kayıtlar, oda sıcaklığında SMVS üzerine bir Giga-ohm mühür oluşturarak yapılır. Veziküller bir Nikon veya Zeiss ters mikroskop ile faz-kontrast mikroskobu ile görüntülenmiştir.
- Membran potansiyeli -100 mV ile yaklaşık 10 saniye süre + 100 mV arasında değişen voltaj 'de muhafaza edilmektedir. Kayıtlar amplifikatör devresi kullanarak 5 kHz filtrelenir. Az 1 pA bir sokak elektrikli veya spesifik olmayan gürültü seviyesi Başarılı kayıt için arzu edilir.
- Veriler tek bir kanal frekansı ve amplitüdü belirlemek etkinlikleri örneğin Clampfit 10.0 yazılımı ile analiz edilmiştir. Voltaj bağımlı bir akım voltaj ilişkisi çizilmesi ile belirlenir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bizim protokol ilk adım, Şekil 1'de Western Blot ile gösterildiği gibi, mitokondri, saflaştırılmış izolasyonu sağlar. Şekil 2'de, bir beyin türevli submitochondrial vezikül yama kayıt bir örneği gösterilmektedir. Iç-dış yama yapılandırma kullanarak biz ATP tarafından modüle kanalı faaliyet göstermektedir. Kontrol (CTL) kayıt (sol) ortalama 600 pS bir tepe iletkenlik özelliğine sahip çok-kanallı iletkenliği aktivite göstermektedir. derhal banyosuna 1 mM ATP ilavesiyle azaltıldı. ATP genel etkisi, konsantrasyona bağımlı bir şekilde SMVS yamalar iletkenliği azaltmak için. SMV-dışı H + gösterge ACMA floresan yoğunluğundaki azalmanın ölçülmesi, Şekil 3'te gösterildiği gibi, F1FO ATPaz etkinliğini ölçmek için, izole edildikten sonra, böylece ATP hidroliz tepki olarak SMVS içine H + iyonları hareketi ölçülür. ATP duyarlı H + SMVS içine iyon tutma ekledikten sonra geliştirilmiştirATP TV'nizi yerleştirmeden. Bu deney, H + iyonunun sekestrasyon etkinliğini ölçmek için kullanılabilir. Daha az verimli SMVS + iyonları daha yavaş ya da daha küçük bir tepe değere H birikir. Örneğin, H + iyonu sekestrasyon Bcl-xL inhibitörleri ve FCCP (Alavian ve ark., 2011) ilave edilerek baskılanmıştır.
| Final Konsantrasyon | |
| Sakaroz | 250 Mm |
| Hepes | 20 Mm |
| EDTA | 1 mm |
| BSA | % 0.5 |
Tablo 1. İzolasyon Tampon.
| Ficoll | 22 ml% 20> |
| Sakaroz | 12 mL 1 M |
| EDTA | 18.75 ul 0.1 M |
| Tris-HCl, | 375 ul 1 M (pH 7.4) |
| Üst Kat Ficoll 7.5% | |
| Ficoll stok | 10 mi |
| İzolasyon Tampon | 6 mi |
| Ficoll altındaki Katman 10% | |
| Ficoll stok | 15.5 mi |
| İzolasyon Tampon | 2.5 mi |
Tablo 2'de. Ficoll Stok.
| KCl | 120 mM |
| NaCl | 8mM |
| EGTA | 0.5 mM |
| Hepes | 10 mM |
| pH | 7.3 |
Tablo 3. İç Solution.
Şekil 1. Lizat Örnek immüno Sitosol ve mitokondri arıtıldı. Üst panel, sitosolik protein GAPDH karşı bir antikor kullanılarak bir immüno gösterir. Alt panel mitokondriyal innner membran proteini CoxIV karşı bir antikor kullanılarak bir immüno gösterir.
Şekil 2. 1 mM ATP ilave öncesi ve sonrası iki temsilcisi yama kelepçe kayıt. Potansiyel Holding +70 mV. Kesikli çizgi 0 pA temsil eder. Her iz 10 saniye boyunca kaydedilir ve izleri arasında 10 saniye yoktur.
Şekil 3,. Floresan yoğunluğu değişim Örnek izleriSMVS varlığında ve ATP yokluğunda (siyah iz) ve durum (kırmızı iz) zaman içinde ACMA göstergesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yöntemler de gösterildiği gibi, burada bu yöntem ile phenotypes.SMVspurified hücre ayrımı olmaksızın bütün beyin 2 adımından sonra, adım 1 ve submitochondrial veziküller (SMVS) sonunda, diğer hücre organelleri kirlenme, esasen saf mitokondri izolasyonu sağlamak tarif edilmektedir Şekil 1 ve daha önceki çalışmaları (Alavian KN ve ark. 8) ve önceki donma kendi yapısal ve fonksiyonel bütünlüğünü korumak. Dondurma ve çözme sonra, mitokondri izole veya SMVS kayıtları ve biyokimyasal deneyleri için kullanılır, ancak solunum çalışmaları için.
Bu yöntem, ayrıca, aynı adımları kullanarak karaciğer mitokondri izole etmek için kullanılabilir. Mitokondri ve SMVS elektrofizyolojik kayıt odasına kaplama zaman kümeleri oluşturma eğilimindedir çünkü, dikkat aşırı topaklanma veya aşırı seyreltme gibi, örnek yükleme verilmelidir possibili azaltabilirmühür oluşumu ty. Ayrıca, dikkat izolasyon başlamadan önce birkaç teknik ayrıntılar verilmelidir. Temiz araçları kullanmak ve buz üzerinde tutmak için çok önemlidir. Tüm işlemler buz üzerinde yapılan ve tüm santrifüj 4 ° C ayarlanmalıdır Ficoll degrade hazırlanması düzgün başarılı bir deney için önemlidir. Ficoll iki konsantrasyonları arasında mükemmel bir ayrılma oluşturma hücre içi fraksiyonların saflığı artırır.
Bu tekniğin bir sınırlama belirli bir beyin bölgesinden örnek substantia nigra pars compactadaki veya striatumdan mitokondri örneğin isteniyorsa küçük olabilir protein nihai miktarı, tarafından uygulanmaktadır. Birçok hayvanlardan alınan örneklerde birbiriyle birleştirilmesi hasat protein toplam miktarını artırmak için gerekli olabilir.
Mitokondri veya SMVS 1 mg / ml 'de bölünüp ve -80 ° C'de saklanır ve birkaç ay süreyle kayıtları için stabildir, ancak preferabl olduğue çözülme sonra mitokondriyal örnek yeniden dondurmak için değil. Bu yöntem ile arıtılmış, veziküller gibi yama kelepçe kayıt farklı yaklaşımlar, biyokimyasal teknikler ve diğer fonksiyonel çalışmalar kullanarak, ATP sintaz incelemek için yararlıdır. Bu hazırlık ile bir ilaç veya F1FO ATPaz aktivitesi ve yapısı küçük moleküllerin etkilerini analiz edebilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle | Krackeler Scientific, Inc. | 1-7725T-5 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| 4639 Cell Disruption Vessel | Parr Instrument Company | 4639 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F5415 | |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | P20314 | |
| SW-50.1 rotor | Beckman Coulter | ||
| L8-70M Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 | |
| Lubrol PX (C12E9) | Calbiochem | 205534 | |
| Axopatch 200B | Axon Instruments | ||
| Digidata 1440A | Molecular Device | ||
| pClamp10.0 | Molecular Device | ||
| Manipulator | Sutter Instrument | ||
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1308325 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87 | Sutter Instrument |
References
- Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
- Duchen, M. R., et al. Mitochondria and calcium in health and disease. Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).
- Lemasters, J. J. Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism. J. Gastroenterol. Hepatol. 22, Suppl 1. S31-S37 (2007).
- Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit. Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).
- Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits. Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).
- Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis. Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).
- Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis. Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).
- Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).
- Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
- Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities. J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).
- Young, H. K. o, Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L.
