Summary
Этот протокол описывает использование пептидов: MHC тетрамеров и магнитных микросфер, чтобы изолировать низкой популяции частота эпитопов Т-клеток и их анализ с помощью проточной цитометрии. Этот метод позволяет непосредственное изучение эндогенных T клеточных популяций интерес со стороны
Abstract
Первой необходимости для исследователей, изучающих адаптивного иммунитета в естественных условиях экспериментальной модели является способность идентифицировать Т-клеток в зависимости от их рецепторов Т-клеточного антигена (TCR) специфичность. Многие косвенные методы доступны, в которых большая часть популяции Т-клеток стимулируется в пробирке со специфическим антигеном и эпитоп-специфических Т-клеток, определяются с помощью измерения функционального ответа, таких как пролиферация, продукции цитокинов, или экспрессия маркеров активации 1. Однако, эти методы только определить эпитоп-специфических Т-клеток с одним из многих возможных функций, и они не достаточно чувствительны, чтобы обнаружить эпитоп-специфических Т-клеток на наивных частоты предшественника. Популярной альтернативой является TCR трансгенных приемных модель передачи, в которых моноклональных Т-клеток от мышей TCR трансгенных высевают в гистосовместимого хостов для создания большого населения предшественник эпитоп-специфических Т-клеток, которые могут быть EASIют отслеживается с использованием антител конгенных маркер 2,3. В то время как мощные, этот метод страдает от экспериментальных артефактов, связанных с нефизиологические частота Т-клеток со спецификой для одного эпитопа 4,5. Кроме того, эта система не может быть использован для исследования функциональной гетерогенности эпитоп-специфических Т-клеточных клонов в поликлональных населения.
Идеальный способ для изучения адаптивного иммунитета должны предусматривать прямое обнаружение эпитоп-специфических Т-клеток от эндогенных репертуара Т-клеток, используя метод, который отличает специфичность TCR исключительно его связывание с родственными пептид: MHC (ПКИКЖ) комплексов. Использование ПКИКЖ тетрамеров и проточной цитометрии решает эту задачу 6, но ограничен обнаружения высокой частотой населения эпитоп-специфических Т-клеток можно найти только следующие антиген-индуцированной клональной экспансии. В этом протоколе, мы опишем метод, который координирует использование тетрамеров ПКИКЖ и Магнетик клетке технологии обогащения позволяют обнаружить крайне низкой частоты эпитоп-специфических Т-клеток от мышей лимфоидной ткани 3,7. С помощью этого метода, можно всесторонне отслеживать весь эпитопа конкретных популяций эндогенных Т-клеток у мышей на всех этапах иммунного ответа.
Protocol
1. Сотовые Изоляция от лимфоидной ткани
- Добавить 1 мл ледяной cEHAA (EHAA + 10% FBS, ручки / стрептококк, гентамицин, 2 мМ L-глутамина, 55 мМ 2-меркаптоэтанола) или другим эквивалентным средних Т-клеток, на 60 мм культуры блюдо с небольшой площадью 100 мкм, нейлоновая сетка и место на льду.
- Усыпить мыши.
- Удалить селезенки и, как многие легко доступны лимфатических узлов, как это возможно. Они должны включать по крайней мере, паховые, подмышечные, плечевой, шейки матки и брыжеечных лимфатических узлов. Поместите их в верхней части нейлоновая сетка в культуре блюдо.
- С помощью плоской вершине замкнутой 1,5 мл трубки микроцентрифужную, мягко разотрите лимфоидной ткани на нейлоновой сетки, чтобы освободить лимфоцитов. Добавить еще 1 мл cEHAA и пипетки вверх и вниз для работы клеток в суспензии. Передача клетки через другой кусок нейлоновой сетки помещается поверх 15 мл центрифужные пробирки из полипропилена. Промойте блюдо и сетка с другой 1 мл ледяной cEHAA, роОлинг объемы в ту же трубу. Повторите для достижения конечного объема клеточной суспензии 4 мл.
- Добавить холодного буфера сортировщик (PBS + 2% FBS, 0,05% азида) до конечного объема 15 мл и центрифугируют трубку в течение 5 мин при 300 мкг, 4 ° C.
- Осторожно аспирации супернатант, убедившись, что нет капель жидкости осталось по бокам трубки. Ресуспендируют осадок клеток в Fc блока (сортировщик буфера + 2.4G2 антитела) до конечного объема равна примерно в два раза, что гранулы себя. Например, селезенки и лимфатических узлов наивные мыши обычно приводит к клеточному осадку около 100 мкл. В этом случае, добавьте 100 мкл блок Fc, чтобы довести объем до 200 мкл. Если большой степени ячейки слипания произошло, аккуратно удалите ячейку комок в этой точке с пипеткой чаевых.
2. Тетрамеров Окрашивание
- Добавить PE-или APC-меченных ПКИКЖ тетрамер до конечной концентрации 10 нМ (или эмпирически оптимизированы концентрации).
- Смешать и инкубаторыТе в течение 1 часа при комнатной температуре (или эмпирически оптимизированы времени и температуры).
- Добавить холодного буфера сортировщика до объема 15 мл и центрифугируют трубку в течение 5 мин при 300 мкг, 4 ° C. Храните образцы на льду или при температуре 4 ° C с этого момента.
- Осторожно аспирации супернатант, убедившись, что нет капель жидкости осталось по бокам трубки. Ресуспендируют осадок клеток в буфере сортировки до конечного объема 200 мкл. Для двойного обогащения тетрамер, ресуспендируют до конечного объема 150 мкл.
3. Магнитного обогащения
- Добавить 50 мкл Miltenyi анти-PE или анти-APC микрошарики. Для двойного обогащения тетрамер, добавить 50 мкл обоих.
- Перемешать и инкубировать в течение 20 мин при 4 ° C.
- Добавить холодного буфера сортировщика до объема 15 мл и центрифугируют трубку в течение 5 мин при 300 мкг, 4 ° C.
- Во время ожидания, создать Miltenyi LS магнитной колонке на магнит MidiMACS или QuadroMACS. Установить открытые 15 мл полипропиленовые центрифужные пробирки наломать непосредственно под колонки.
- Добавьте 3 мл сортировщик буфера в верхней части колонны, что позволяет ей стекать в 15 мл трубки.
- Поместите 100 мкм нейлоновой сетки квадрат на верхнюю часть колонны.
- Когда клетки закончили спиннинг, тщательно аспирации супернатант и ресуспендируют осадок в 3 мл буфера сортировки.
- Передача клеточной суспензии через нейлоновую сетку на верхней части колонны.
- Когда клеточная суспензия полностью сливают в колонку, промыть оригинальной трубки с другом 3 мл буфера сортировки и передачи буфера через нейлоновую сетку в колонну, промывка сетки в процессе. Откажитесь от нейлоновой сетки.
- Когда буфер полностью сливают в колонку, добавить еще 3 мл буфера для сортировки столбцов.
- Повторите шаг 10 на общую сумму 3 х 3 стирок мл.
- Удалить столбец из магнитов и место над новым 15 мл центрифужные пробирки из полипропилена.
- Добавить 5 мл буфера для сортировки тОн колонки.
- Немедленно вставить поршень в верхней части колонны и в одном непрерывном движении, нажмите на поршень до упора, заставляя буфера из колонки в трубку.
- Центрифуга пробирки, содержащие Элюированную связанной фракции и проточные несвязанной фракции в течение 5 мин при 300 мкг, 4 ° C.
- Осторожно аспирации супернатант из фракции связанных, убедившись, что нет капель жидкости осталось по бокам трубки. Ресуспендируют осадок клеток в буфере сортировки до конечного объема 95 мкл точно. Аспирируйте и ресуспендируют несвязанной фракции в конечном объеме 2 мл.
4. Проточной цитометрии
- Для каждой фракции, удалите 5 мкл и добавляют к 200 мкл считая бусины (с учетом концентрации 200000 / мл в буфере сортировки) в 5 мл трубки FACS. Отложите при 4 ° С для анализа позже. Чтобы сэкономить время, гранулы могут быть заранее помечены аликвоты для труб до начала эксперимента.
- Подготовка утраастра смесь антител для окрашивания поверхностных маркеров на клетках (табл. 1). Чтобы сэкономить время, это может быть сделано до начала эксперимента.
- Для связанной фракции, добавить дозу антител коктейль непосредственно на ~ 90 мкл клеток в пробирке. Если анализ несвязанные фракции желании передать 90 мкл клеток в 5 мл трубки FACS и добавить дозу антител коктейль.
- Настройка панели одноцветные управления компенсацию за проточной цитометрии. Для каждого флуорохромом, которые будут использоваться, смешайте 50 мкл клеток оставшиеся свободные фракции в 5 мл трубки FACS с 1 мкл анти-CD4 антитела, конъюгированные с соответствующим флуорохромом. Не забудьте настроить неокрашенных контроль.
- Vortex и инкубировать всех образцов в течение 30 мин при 4 ° C.
- Добавить 5 мл сортировщик буфера в каждую пробирку и центрифугируют в течение 5 мин при 300 мкг, 4 ° C.
- Для связанной фракции, тщательно супернатант и ресуспендирования клеток в 200 мкл буфера сортировщикФер. Передача клеток в 1,2 мл микропробирок FACS. Промойте трубку с еще 200 мкл буфера сортировки и бассейн в тот же микропробирок. Если в ячейке скопления очевидны, проходят клетки через 50 мкм фильтр.
- Для фракция несвязанного и компенсаций управления, переливать или аспирации супернатант и ресуспендируют в 2 мл буфера сортировки.
- Настройка цитометра использованием одного цвета контроля компенсации. Выберите сторону разброса ширины (SSC-W) в качестве дополнительного параметра для записи.
- Анализ окрашенных образцов с использованием последовательности последовательных ворот включения для определения CD4 + и CD8 + Т-клеток, как показано на рисунках 1 и 2. Для связанных фракций, собирать столько ячеек, сколько возможно до максимума 2000000 Всего событий. Для несвязанных фракций, собрать 1.000.000 общего событий. Держите скорость сбора данных на уровне или ниже 3000 событий в секунду.
- Используя те же настройки машины, анализировать считая шарик образцов. Соберите 10000 Всего событий. </ Li>
- Сохранить все данные в виде файлов FCS.
5. Анализ данных
- Анализ FCS файлы данных для подсчета борта образцов с использованием FlowJo программного обеспечения. Участок рассеяния вперед по FITC и установить ворота aroung считая бусины (рис. 1 и 2). Определите общее количество считая бусины обнаружены в каждом образце. Вычтем из общего количества собранных событий, чтобы определить количество клеточных событий, собранных.
- Рассчитайте общее число всех клеток в каждом образце с помощью уравнений, изложенные во вставке 1.
- Анализ FCS файлы данных для окрашенных связанных и несвязанных образцов фракции. Настройка последовательности последовательных ворот включения для выявления лимфоидной +, побочные разброс ширины вот, самосвалы, CD3 +, CD4 + и CD8 +, тетрамер + Т-клеток в каждом образце, как показано на рисунках 1 и 2.
- Умножьте общее количество клеток в образце частоты каждого включения ворота используются для определения CD4 + тетрамер+ Или CD8 + тетрамер + клеток для расчета общего количества эпитопов Т-клеток (вставка 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показана представитель проточной цитометрии участков pMHCII тетрамер обогащенных образцов селезенки и лимфатических узлов от наивных мышей, а на рисунке 2 показаны репрезентативные данные для мышей, иммунизированных ранее с соответствующим пептидом + CFA. Серийный стробирования удаляет аутофлуоресцентной и другие нежелательные события из анализа популяции CD4 + Т-клеток. CD8 + Т-клеточной популяции служит полезным внутреннего отрицательного контроля за pMHCII тетрамер окрашивания CD4 + Т-клеток. Обратите внимание, что связанные фракций от обогащения обычно содержат значительно более высокую долю аутофлуоресцентной клеток, чем несвязанные фракции, что делает стробирования более сложной.
Абсолютное число эпитоп-специфических Т-клеток в образце рассчитывается путем умножения общего количества всех клетках в связанном доли обогащенного образца, а определяется из шарика анализ счета, при этом доля этих клеток, которые являются тетрамер +, так как определительопределен из анализа клетки окрашивания (вставка 1).
Для наивного мыши на рисунке 1, концентрация всех клетках в связанном фракции образца (4411/5589) (200.000) (0.200/0.005) = 6,31 х 10 6 / мл. Общее количество всех клеток в образце (6,31 х 10 6 / мл) (0,095) = 6,00 х 10 5. Наконец, общее число эпитоп-специфических CD4 + Т-клеток (6,00 х 10 5) (41,5%) (96,6%) (10,2%) (62,3%) (0,64%) = 98.
Для иммунизированных мышей на рисунке 2, концентрация всех клетках в связанном фракции образца (6410/3590) (200.000) (0.200/0.005) = 1,43 х 10 7 / мл. Общее количество всех клеток в образце (1,43 х 10 7 / мл) (0,095) = 1,36 х 10 6. Наконец, общее число эпитоп-специфических CD4 + Т-клеток (1,36 х 10 6) (40,9%) (93,9%) (9,54%) (72,0%) (42,7%) = 1,53 х 10 4 </ STRONG>.
Эффективность обогащения снижается как число эпитопов Т-клеток увеличивается 8, так тетрамер + клеток может рассматриваться в несвязанной фракции образцов, содержащих очень высокие частоты эпитопов Т-клеток. В таких случаях количество эпитопов Т-клеток, присутствующих в несвязанной фракции могут быть рассчитаны отдельно и добавляется к числу находятся в связанной фракции. Таким образом, на рисунке 2, концентрация всех клеток в несвязанной фракции образца (9031/969) (200.000) (0.200/0.005) = 7,46 х 10 7 / мл, общее число всех клеток (7,46 х 10 7 / мл) (2,0) = 1,49 х 10 8, а общее число эпитоп-специфических CD4 + T-клеток (1,49 х 10 8) (62,7%) (96,4%) (44,5%) (54,7%) (0,0409 %) = 8,97 · 10 3. Добавление номера в связанных и несвязанных фракций, есть 1,53 х 10 4 + 8,97 · 10 3 = 2,43 х10 4 общего эпитоп-специфических CD4 + Т-клеток во всей выборке. Действительно, если эпитопа конкретной ячейки расширения является достаточно надежной, процесса обогащения могут быть пропущены.
| Флюорохром | Антитело |
| Pacific Blue | дамп (B220, CD11b, CD11c, F4/80) |
| Тихоокеанский Оранжевый | CD8 |
| FITC | CD3 |
| PE | ПКИКЖ тетрамера или фенотипического маркера |
| PerCP | CD4 |
| APC | ПКИКЖ тетрамера или фенотипического маркера |
| AlexaFluor 700 | CD44 |
Таблица 1. Предлагаемая стратегия окрашивание антител
: Содержание ширина = "6in" FO: SRC = "/ files/ftp_upload/4420/4420fig1highres.jpg" SRC = "/ files/ftp_upload/4420/4420fig1.jpg" />
Рисунок 1. Проточной цитометрии анализа эпитоп-специфических CD4 + Т-клеток у наивных мышей после pMHCII тетрамера на основе обогащения. Представитель участков приведены для оценки (A) и несвязанных (B) фракций. Правопреемства ворота устанавливаются для выбора лимфоидной-разброс +, бок о рассеянии widthlo, самосвалы, CD3 + события. Из них CD4 + или CD8 + события закрытом для анализа эпитоп-специфических Т-клеток или фоновое окрашивание. Аликвоты неокрашенных клеток из оценки (C) и несвязанным (D) фракцию смешивают с люминесцентными подсчета бусы и анализируются отдельно. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
oad/4420/4420fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Проточной цитометрии анализа эпитоп-специфических CD4 + Т-клеток в пептид-иммунизированных мышей после pMHCII тетрамера на основе обогащения. Представитель участков приведены для оценки (A) и несвязанных (B) фракций. Правопреемства ворота устанавливаются для выбора лимфоидной-разброс +, бок о рассеянии widthlo, самосвалы, CD3 + события. Из них CD4 + или CD8 + события закрытом для анализа эпитоп-специфических Т-клеток или фоновое окрашивание. Аликвоты неокрашенных клеток из оценки (C) и несвязанным (D) фракцию смешивают с люминесцентными подсчета бусы и анализируются отдельно. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Вставка 1. Расчет эпитоп-специфических Т-номера сотовых
Абсолютное число эпитопов Т-клеток лучше всего рассчитаны с помощью флуоресцентного подсчета бусы. Аликвоту неокрашенныхклеток из каждого образца смешивают с определенным объемом считая бусины установлен в известной концентрации, а затем анализировали с помощью проточной цитометрии. Концентрация клеток в образце может быть выведено из сравнения их частоты с известной концентрацией люминесцентных подсчета бусы.
Общее количество клеток в образце рассчитывается путем умножения концентрации клеток с общим объемом выборки.
Общее количество эпитоп-специфических Т-клеток в образце просто общее число всех клеток в образце, умноженная на процент клеток, которые являются тетрамер-положительный.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ПКИКЖ тетрамера на основе метода обогащения клетки представленные этого протокола является мощным инструментом для изучения эпитоп-специфических Т-клеток от эндогенных T репертуар клетки. Использование тетрамеров ПКИКЖ позволяет обнаруживать эпитоп-специфических Т-клеток основан непосредственно на способность их ТКО, чтобы связать родственные ПКИКЖ лигандами. Обогащение обеспечивает уровень чувствительности, что крайне редко населения антиген-специфические Т-клетки могут быть обнаружены эндогенные репертуара Т-клеток, без каких-либо манипуляций их генетической или прекурсоров частоты. В результате, этот метод позволяет следователю непосредственно отслеживать эндогенный антиген-специфические Т-клеточной популяции в естественных условиях из экспериментальных систем с их наивными уровней на всех этапах иммунного ответа.
Этот протокол был оптимизирован для использования ПКИКЖ класса II (pMHCII) тетрамеры, чтобы обогатить эпитоп-специфических CD4 + Т-клеток из вторичного лимфоидного органас мышей. Однако, этот метод также применим к ПКИКЖ класса I (pMHCI) тетрамеров и CD8 + Т-клеток 9. В отличие от CD4, CD8 корецепторов играет важную роль в стабилизации TCR-MHC взаимодействия, а это может иметь практическое значение для pMHCI тетрамер окрашивание 10. В частности, использование CD8 антител должно быть ограничено клоны, которые не влияют на CD8-тетрамер обязательным, и они должны быть добавлены к клеткам после окрашивания тетрамер. Действительно, некоторые pMHCI тетрамеров были разработаны с мутациями MHCI-CD8 сайты связывания для смягчения неспецифического связывания с CD8 + Т-клеток 11,12.
Тетрамеров концентрации, времени инкубации и температуры инкубации может существенно повлиять на эффективность окрашивание тетрамера, и условия должны быть оптимизированы для достижения наилучшего сочетания высокой сигнала тетрамер, низкий фоновый сигнал, низкий интернализации тетрамера, и минимальные изменения в физиологии клетки. В идеале, эти условия должны бэлектронной эмпирически определяется для каждого уникального реагента. В наших руках, однако, конечной концентрации 10 нМ и инкубация 1 час при комнатной температуре, обеспечивает хорошие общие условия для наиболее pMHCI или pMHCII тетрамеров. В общем, pMHCI тетрамеры, кажется, пятно легче, чем тетрамеры pMHCII и окрашивание часто может быть выполнена при 4 ° С всего за 30 минут.
Масштабы этой процедуры подходят для анализа практически всех вторичных лимфоидных органах мышей в одном образце. Таким образом, каждый образец представляет собой достаточно полный анализ всей циркулирующей периферической Т-клеточной репертуар мыши. Эпитоп-специфических Т-клеток может также быть обогащен из других соответствующих тканей, в том числе вилочковой железы 13,14. Когда thymii от 4-5 недельных мышах анализируются, эпитопа конкретных одного положительного тимоцитов могут быть обнаружены на номера похожи на те, периферической наивных Т-клеток. Эпитопа конкретных дважды положительных тимоцитов,Однако, очень трудно обнаружить из-за их низкого уровня экспрессии TCR.
Этот протокол также может быть адаптирована для обнаружения эпитоп-специфических человеческих CD4 + и CD8 + Т-клеток в крови и других тканях 15-17. Частота эпитопов Т-клеток примерно такой же, между мышах и людях 17, поэтому анализ 50 - 100 мл крови даст сопоставимые числа эпитоп-специфических Т-клеток, как объединенные селезенки и лимфатических узлов мышей 18.
Одна из основных задач в проточной цитометрии анализа клеток после тетрамера на основе обогащения отличительной реальных событиях клетки от фона. Во многом это связано с тем, что многие аутофлуоресцентной клетки также не специально обогащенной в ходе процесса. Если тщательно не закрытый, эти аутофлуоресцентной клетки могут появляться как ложные тетрамер-положительных клеток и сбросить точности анализа, в частности, в случае редких наивных Т-клеток рopulations. Наш протокол использует два шага стробирования стратегия, в которой CD3 + события, в первую закрытом от свалки линии + события, а затем CD4 + события закрытом от CD8 + события. В процессе аутофлуоресцентной клеток, которые, как правило, лежат по центру диагонали любом участке FACS, являются закрытый из анализа двух итерационных шагов. Эффективное удаление аутофлуоресцентной событий происходит за счет многих флуоресцентные цвета, поэтому мы настоятельно рекомендуем использовать поток цитометров способна по крайней мере 6 флуоресцентных параметров.
Большинство ПКИКЖ тетрамеров сопряжены с PE и APC из-за яркости этих флуорохромы, и анти-PE и анти-APC магнитных микросфер легко доступны для включения обогащения с ними. Тем не менее, другие флуорохромы также может быть использован, пока соответствующие магнитные микрошарики имеются. Действительно, несколько тетрамеры с различными флуорохромом этикетки могут быть использованы вместе с соответствующими антителами конъюгированных микрофонrobeads одновременно обогатить нескольких эпитоп-специфических Т-клеточных популяций из того же образца. Мы наметили очень основные антитела флуорохромом установки, которая оптимизирована для использования PE-и APC-меченных тетрамеры (табл. 1), но и многих других эффективных комбинаций можно увеличить гибкость в изучении фенотипических маркеров.
CD8 + Т-клеток популяции может быть использован в качестве внутреннего отрицательного контроля, так как они не должны связываться с pMHCII лигандами (и наоборот для эпитоп-специфических CD8 + Т-клеток обогащения). Частота тетрамер + CD8 + клеток в образце обеспечивает хорошую оценку уровня фонового окрашивания тетрамер, хотя добросовестные тетрамер-положительных CD8 + Т-клеток с поперечным ограниченной специфичностью к pMHCII эпитопы могут существовать при очень малых частотах 19. Иногда во время очень сильного иммунного ответа, эти клетки могут существовать в расширенном частот. При желании, TCR трансгенных Т-клеток, остроумиеч, или без соответствующих специфике эпитопа может быть использована в качестве дополнительного положительного и отрицательного контроля. Отметим, что по неизвестным причинам, некоторые TCR трансгенных клеток и гибридом не хорошо окрашиваются их соответствующих тетрамеров.
Наш протокол предполагает использование флуоресцентных считая бусины для оказания помощи в расчете числа клеток. В то время как количество клеток также может быть достигнуто вручную с гемацитометре, мы обнаружили, что использование результатов подсчета бусины в гораздо большей точности эксперимента, особенно, когда несколько следователей занимаются. Из-за малого числа и объемов ячеек, которые обрабатываются в этом протоколе, минимизация погрешности эксперимента должно быть высоким приоритетом.
Тетрамеров окрашивания совместимы с фиксацией клеток и проницаемости, и несколько исследований успешно проанализированы внутриклеточных цитокинов и экспрессии фактора транскрипции в клетках после тетрамера на основе ячейки обогащением 20,21.Тем не менее, дополнительные шаги способствуют дополнительным потерям клетки в образцах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Андре Хан и Лоуренс иен для оказания технической помощи, а также члены Дженкинс лаборатории за помощь в развитии этого протокола.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PE or APC conjugated pMHC tetramer (or multimer) | Made by investigator, obtained from the NIH tetramer core, or purchased from commercial sources | ||
| Anti-PE conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | |
| Anti-APC conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| LS magnetic columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MidiMACS or QuadroMACS magnet | Miltenyi | 130-042-302 or 130-090-976 | |
| Cell counting beads | Life Technologies | PCB-100 |
References
- Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L.
- Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo. Immunity. 1, 327-339 (1994).
- Moon, J. J.
- Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
- Marzo, A. L. Initial T cell frequency dictates memory CD8+ T cell lineage commitment. Nat Immunol. 6, 793-799 (2005).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nature reviews. Immunology. 11, 551-558 (2011).
- Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
- Seah, S. G. The linear range for accurately quantifying antigen-specific T-cell frequencies by tetramer staining during natural immune responses. European Journal of Immunology. 41, 1499-1500 (2011).
- Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection. Immunity. 28, 859-869 (2008).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
- Pittet, M. J. Alpha 3 domain mutants of peptide/MHC class I multimers allow the selective isolation of high avidity tumor-reactive CD8 T cells. Journal of Immunology. 171, 1844-1849 (2003).
- Choi, E. M. High avidity antigen-specific CTL identified by CD8-independent tetramer staining. Journal of Immunology. 171, 5116-5123 (2003).
- Chu, H. H. Positive selection optimizes the number and function of MHCII-restricted CD4+ T cell clones in the naive polyclonal repertoire. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11241-11245 (2009).
- Chu, H. H., Moon, J. J., Kruse, A. C., Pepper, M., Jenkins, M. K. Negative Selection and Peptide Chemistry Determine the Size of Naive Foreign Peptide-MHC Class II-Specific CD4+ T Cell Populations. J Immunol. 185, 4705-4713 (2010).
- Legoux, F. Impact of TCR reactivity and HLA phenotype on naive CD8 T cell frequency in humans. J Immunol. 184, 6731-6738 (2010).
- Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K., Hasan, M., Albert, M. L. Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies. Blood. 115, 3718-3725 (2010).
- Kwok, W. W. Frequency of Epitope-Specific Naive CD4+ T Cells Correlates with Immunodominance in the Human Memory Repertoire. Journal of Immunology. 188, 2537-2544 (2012).
- Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands. Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).
- Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent. Immunity. 4, 337-347 (1996).
- Burchill, M. A. Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire. Immunity. 28, 112-121 (2008).
- Pepper, M. Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells. Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).
