A Molecular Auslesen Langfristige Olfactory Anpassung in<em> C. elegans</em
Summary
Hier beschreiben wir eine molekulare Auslesen der langfristigen olfaktorische Anpassung<em> Caenorhabditis elegans</em>. Die Protein Kinase G, EGL-4, ist für einen stabilen Anpassungsmaßnahmen im primären sensorischen Neuronen Paar genannt AWC. Bei längerem Geruch Exposition EGL-4 transloziert aus dem Cytosol an Kern der AWC.
Abstract
Während anhaltende Stimulation meisten sensorischen Neuronen wird ihre Reaktion durch eine Verringerung ihrer Empfindlichkeit gegenüber dem Signal anzupassen. Die Anpassung Resonanz hilft Form Aufmerksamkeit und schützt die Zellen vor Reizüberflutung. Anpassung innerhalb des olfaktorischen Schaltung C. elegans wurde zuerst von Colbert und Bargmann 1,2 beschrieben. Hier haben die Autoren Parameter der olfaktorischen Adaption Paradigma, das sie verwendet, um einen genetischen Screen entwerfen zu isolieren Mutanten in ihrer Fähigkeit, an flüchtigen Gerüchen, erfasst durch den Amphid Flügel Zellen Typ C (AWC) sensorischen Neuronen anzupassen definiert. Wenn Wildtyp C. elegans Tiere werden zu einem attraktiven AWC-spürte Geruch 3 für 30 min ihre Reaktionsfähigkeit auf den Geruch wird anzupassen ausgesetzt und ignoriert dann die Anpassung Geruch in einem Chemotaxis Verhaltens Assay für ~ 1 Stunde. Wenn Wildtyp C. elegans Tiere werden zu einem attraktiven AWC-spürte Geruch für ~ 1 Stunde ausgesetzt werden sie dann ignorieren Sie die Anpassung Geruch in achemotaxis Verhaltens Assay für ~ 3 Std. Diese beiden Phasen der olfaktorischen Anpassung in C. elegans wurden als kurzfristige olfaktorische Adaption (induziert nach 30 min Geruch Belichtung) und langfristige olfaktorischen Adaption (induziert nach 60 min Geruch Exposition) beschrieben. Später von L'Etoile et al. Arbeiten, freigelegt 4 ein Protein Kinase G (PKG) genannt EGL-4, die sowohl für die kurz-und langfristigen olfaktorische Anpassung AWC Neuronen benötigt wird. Die EGL-4-Protein enthält eine Kernlokalisierungssequenz, die zur langfristigen olfaktorischen Anpassungsmaßnahmen aber entbehrlich für kurzfristige olfaktorischen Adaption Reaktionen im AWC 4 ist. Durch die Kennzeichnung EGL-4 mit einem grün fluoreszierenden Protein, war es möglich, die Lokalisation von EGL-4 im AWC bei längerer Exposition Geruch zu visualisieren. Mit diesen vollständig funktionellen GFP-markierten EGL-4 (GFP :: EGL-4)-Molekül ist es uns gelungen, eine molekulare Auslesen langfristige olfaktorischen Adaption im AWC 5 zu entwickeln. Mit dieser molecular Auslesen der olfaktorischen Anpassung konnten wir sowohl vorwärts und rückwärts genetischen Screens durchführen, um mutierte Tiere, die defekte subzelluläre Lokalisation Muster der GFP :: EGL-4 weisen in der AWC 6,7 identifizieren. Hier beschreiben wir: 1) die Konstruktion von GFP :: EGL-4 Ausdruck Tieren; 2) das Protokoll für den Anbau von Tieren für die langfristige geruchs-induzierte nukleäre Translokation Assays, und 3) die Wertung der langfristigen geruchs-induzierte Kerntranslokation Event-und Recovery-(Re-Sensibilisierung) aus der nuklearen GFP :: EGL-4 Zustand.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Geruch nukleärer Eingabe eines GFP-markierten EGL-4-Molekül hier beschriebenen bietet eine robuste molekulare Auslesen der olfaktorischen Anpassung in C. elegans. Die Geruchs-induzierte nukleäre Translokation Assays sind einfach und erfordern nur ein paar Tage Vorbereitungszeit. Die pyIs500 Tier, das wir für diese Assays aufgebaut haben, drückt eine Markierung, die die AWC Neuron als auch als Ausdruck der GFP-markierten EGL-4-Protein leuchtet. So fühlen wir, dass ein Experimentator mit wenig …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Scott Hamilton, und die Mitglieder der O'Halloran Labor für sorgfältige Lektüre des Manuskripts danken. Wir danken auch unseren anonymen Gutachter für gute Vorschläge und aufschlussreiche Kommentare.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Bacto Agar | Difco | DF0140-07-4 | NGM plates |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | S671-10 | NGM plates |
| Bacto Peptone | Difco | DF0118-07-2 | NGM plates |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Chemical | S375-500 | S-Basal buffer and NGM plates |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Chemical | P285-500 | S-Basal buffer and NGM plates |
| Kimwipes – Small | Kimberly-Clark | LS2770 | |
| Ethanol 100% | Gold Shield Chemical Co. | 43196-115 | diluting odors for chemotaxis assays |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C8106-500G | NGM plates |
| Magnesium Sulphate | MP Biomedicals | 150136-500G | NGM plates |
| Sodium Azide 99% | Fisher Scientific | ICN10289180 | Anesthetic |
| Agarose – UltraPure | Invitrogen | 16500-500 | Agarose pads |
| Benzaldehyde | Sigma-Aldrich | B1334-100G | AWC odor |
| Butanone, ACS Grade | Sigma-Aldrich | 360473-500ML | AWC odor |
| Microcentrifuge Tubes – 1.5 ml Colored | Denville | LS8147 | |
| Pasteur Pipet Disposable Glass 5-3/4″ | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| Stratalinker | Stratagene | Stratalinker 2400 | UV integration |
| Filter Vacuum Bottle – 500 ml | Nalgene | 09-740-25B |
Referências
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- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learning and Memory. 4 (2), 179 (1997).
- Bargmann, C. I., et al. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Neuron. 74 (3), 515 (1993).
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