En molekylär Avläsning av långsiktigt Olfactory anpassning i<em> C. elegans</em
Summary
Här beskriver vi en molekylär avläsning av långvarig lukt anpassning<em> Caenorhabditis elegans</em>. Den proteinkinas G, EGL-4, är nödvändig för stabila anpassningsåtgärder i den primära sensoriska neuron par kallas AWC. Under längre lukt exponering EGL-4 translokeras från cytosolen till kärnan i AWC.
Abstract
Under ihållande stimulering mest sensoriska neuroner kommer att anpassa sina svar genom att minska deras känslighet för signalen. Anpassningen svar hjälper form uppmärksamhet och även skyddar cellerna från över-stimulering. Anpassning inom lukt kretsen av C. elegans beskrevs först av Colbert och Bargmann 1,2. Här författarna definierade parametrarna för luktsinnet anpassningen paradigm, som de använde för att utforma en genetisk skärm för att isolera mutanter defekta i sin förmåga att anpassa sig till flyktiga lukt avkännas av Amphid Wing celler av typ C (AWC) sensoriska neuroner. När vildtyp C. elegans djur utsätts för en attraktiv AWC-kände lukt 3 för 30 minuter som de kommer att anpassa sin lyhördhet för lukt och kommer då att ignorera anpassa lukt i en kemotaxi beteende analys för ~ 1 timme. När vildtyp C. elegans djur utsätts för en attraktiv AWC-kände lukt för ~ 1 timme som de sedan kommer att ignorera anpassa lukt i AChemotaxis beteende analys för ~ 3 timmar. Dessa två faser lukt anpassning i C. elegans beskrevs som kortvarig lukt anpassning (induceras efter 30 min lukt exponering), och långsiktig lukt anpassning (induceras efter 60 min lukt exponering). Senare arbete från L'Etoile et al. Avslöjat 4 en proteinkinas G (PKG) kallas EGL-4 som krävs för både kort och lång sikt lukt anpassning i AWC nervceller. Det EGL-4-protein innehåller en nukleär lokalisering sekvens som är nödvändig för långsiktiga lukt anpassningsåtgärder men umbärliga för kortfristiga lukt anpassningsåtgärder i AWC 4. Genom märkning EGL-4 med ett grönt fluorescerande protein, var det möjligt att visualisera lokaliseringen av EGL-4 i AWC under långvarig lukt exponering. Med hjälp av denna fullt fungerande GFP-märkta EGL-4 (GFP :: EGL-4)-molekylen har vi kunnat utveckla en molekylär avläsning av långvarig lukt anpassning i AWC 5. Med användning av denna molecular avläsning av luktsinnet anpassning har vi kunnat utföra både framåt och bakåt genetiska skärmar för att identifiera muterade djur som uppvisar defekta subcellulära lokalisering mönster av GFP :: EGL-4 i AWC 6,7. Här beskriver vi: 1) konstruktion av GFP :: EGL-4 uttryckande djur, 2) protokollet för odling av djur för långsiktiga lukt-inducerad nukleär translokation analyser, och 3) poäng i den långsiktiga lukt-inducerad nukleär translokation händelse och återhämtning (åter allergi) från den nukleära GFP :: EGL-4 tillstånd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den lukt-inducerad kärnkraft inmatning av en GFP-märkt EGL-4-molekylen som beskrivs här ger en robust molekylär avläsning av luktsinnet anpassning C. elegans. De lukt-inducerade nukleär translokation analyser är enkla och kräver bara några dagars förberedelsetid. Den pyIs500 djur som vi har konstruerat för dessa analyser, uttrycker en markör som belyser AWC neuron samt uttrycker GFP-märkta EGL-4-proteinet. Därför anser vi att en försöksledaren med liten eller ingen erfarenhet av att ar…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Scott Hamilton och medlemmar av O'Halloran labb för noggrann läsning av detta manuskript. Vi tackar också våra anonyma granskare för utmärkta förslag och kommentarer insiktsfulla.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Bacto Agar | Difco | DF0140-07-4 | NGM plates |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | S671-10 | NGM plates |
| Bacto Peptone | Difco | DF0118-07-2 | NGM plates |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Chemical | S375-500 | S-Basal buffer and NGM plates |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Chemical | P285-500 | S-Basal buffer and NGM plates |
| Kimwipes – Small | Kimberly-Clark | LS2770 | |
| Ethanol 100% | Gold Shield Chemical Co. | 43196-115 | diluting odors for chemotaxis assays |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C8106-500G | NGM plates |
| Magnesium Sulphate | MP Biomedicals | 150136-500G | NGM plates |
| Sodium Azide 99% | Fisher Scientific | ICN10289180 | Anesthetic |
| Agarose – UltraPure | Invitrogen | 16500-500 | Agarose pads |
| Benzaldehyde | Sigma-Aldrich | B1334-100G | AWC odor |
| Butanone, ACS Grade | Sigma-Aldrich | 360473-500ML | AWC odor |
| Microcentrifuge Tubes – 1.5 ml Colored | Denville | LS8147 | |
| Pasteur Pipet Disposable Glass 5-3/4″ | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| Stratalinker | Stratagene | Stratalinker 2400 | UV integration |
| Filter Vacuum Bottle – 500 ml | Nalgene | 09-740-25B |
Referências
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans. Neuron. 14 (4), 803 (1995).
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learning and Memory. 4 (2), 179 (1997).
- Bargmann, C. I., et al. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Neuron. 74 (3), 515 (1993).
- L’Etoile, N. D., et al. The cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 regulates olfactory adaptation in C. elegans. Neuron. 36, 1079-10 (2002).
- Lee, J. I., et al. Nuclear entry of a cGMP-dependent kinase converts transient into long-lasting olfactory adaptation. PNAS. 107 (13), 6016 (2010).
- O’Halloran, D. M., et al. Regulators of AWC-mediated olfactory plasticity in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (12), e1000761 (2009).
- O’Halloran, D. M., et al. Changes in cGMP levels affect the localization of EGL-4 in AWC in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7 (2), e31614 (2012).
- Mello, C. C., et al. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO Journal. 10, 3959-39 (1991).
- Miyabayashi, T., et al. Expression and function of members of a divergent nuclear receptor family in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 215, 314 (1999).
- L’Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Olfaction and odor discrimination are mediated by the C. elegans guanylyl cyclase ODR-1. Neuron. 25 (3), 575 (2000).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451 (1995).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. Wormbook. , (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77 (1), 71 (1974).
- Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays. J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).
- Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson’s Disease Genes. J. Vis. Exp. (17), e835 (2008).
- Pittenger, C., Kandel, E. R. In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358 (1432), 757 (2003).
