جيل واسترداد خلايا β الأجسام الشبه الكروية من الهلاميات المائية PEG-الببتيد الخطوة النمو
Summary
بروتوكول التالية توفر تقنيات التغليف البنكرياس β-cells في الهلاميات المائية PEG-الببتيد خطوة نمو ردود الفعل التي شكلتها الصورة مزدوجا فوق ثيول-إيني. هذا البرنامج ليس فقط المواد يقدم المكروية لتغليف الخلايا cytocompatible، ولكن أيضا يسمح للمستخدم التحكم الانتعاش السريع للهياكل الخلية تشكلت في الهلاميات المائية.
Abstract
الهلاميات المائية هي البوليمرات ماء crosslinked التي توفر المكروية ثلاثية الأبعاد مع الأنسجة مثل مرونة ونفاذية عالية للخلايا ذات الصلة زراعة الأنسجة أو علاجية. يتزايد استخدام الهلاميات المائية المحضرة من بولي (إيثيلين جليكول) (PEG) المشتقات لمجموعة متنوعة من التطبيقات هندسة الأنسجة، ويرجع ذلك جزئيا إلى ممتلكاتهم والانضباطي cytocompatible. في هذا البروتوكول، ونحن تستخدم ثيول-إيني خطوة نمو photopolymerizations الى افتعال PEG-الببتيد الهلاميات المائية للتغليف البنكرياس MIN6 الخلايا البائية. وتم تشكيل المواد الهلامية التي كتبها 4-الذراع macromer (PEG4NB) PEG-نوربورنين وcrosslinker الببتيد كيموتربسين حساسة (CGGYC). طبيعة ماء وغير تلوث من PEG يقدم المكروية cytocompatible لبقاء الخلية والانتشار في 3D، في حين أن استخدام تسلسل الببتيد كيموتربسين حساسة (C GGY ↓ C، سهم يشير إلى الانقسام انزيم موقع، في حين كيسة محطةأضيفت مخلفات eine للثيول-إيني يشابك) يسمح الانتعاش السريع للبنيات الخلية تشكيل هيدروجيل داخل. بروتوكول التالية بالتفصيل تقنيات ل: (1) تغليف من MIN6 β-cells في ثيول-إيني الهلاميات المائية، (2) نوعية وكمية المقايسات بقاء الخلية لتحديد بقاء الخلية والانتشار، (3) استرداد الأجسام الشبه الكروية الخلية باستخدام كيموتربسين بوساطة هلام تآكل، و(4) التحليل البنيوي والوظيفي للالأجسام الشبه الكروية استردادها.
Introduction
الهلاميات المائية هي البوليمرات ماء crosslinked مع إمكانات استثنائية كمواد سقالات للإصلاح وتجديد أنسجة 1-3 من محتوى الماء عالية من الهلاميات المائية يسمح نشر سهلة من الأوكسجين والمواد المغذية وتبادل المنتجات الأيضية الخلوية، والتي تعتبر حاسمة للحفاظ على بقاء الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، الهلاميات المائية يحملون ممتازة لإطلاق وتسليم خلية تسيطر عليها بسبب tunability العالية .. 2 الهلاميات المائية الاصطناعية مثل تلك المحضرة من بولي (إيثيلين جليكول) (PEG) تستخدم بشكل متزايد في تطبيقات هندسة الأنسجة، إلى حد كبير بسبب cytocompatibility بهم، الأنسجة مثل مرونة، وtunability عالية في المواد الخصائص الفيزيائية والميكانيكية 4-6
على الرغم من أن منصة هيدروجيل شيوعا، وقد أظهرت الدراسات أن PEG diacrylate (PEGDA) الهلاميات المائية التي شكلتها سلسلة النمو photopolymerizations لديهم ميل إلى تلف خلايا مغلفة الدورينانوغرام يشابك شبكة والتغليف في الخلية الموقع .. 7 ويعزى إلى حد كبير إلى تلف الخلايا الراديكالية الأنواع التي تم إنشاؤها بواسطة جزيئات photoinitiator، الذي نشر من خلال مجموعات الفينيل على PEGDA لسلاسل البوليمر تشعبي في الهلاميات المائية. للأسف، هذه الأنواع المتطرفة أيضا أن يسبب تلف الخلايا الضغوط والتغليف خلال الخلية، وخاصة بالنسبة للراديكالية الخلايا الحساسة للالبنكرياس β مثل خلايا 8-10 من أجل الحصول على أعلى حجم شبكة لأفضل نشرها وبقاء الخلية، والأوزان الجزيئية أعلى PEGDA وغالبا ما تستخدم لتغليف الخلايا. هذا، ومع ذلك، يعرض للخطر حركية البلمرة ويسبب خصائص هلام دون المستوى الأمثل البيوفيزيائية. 7،11،12 بالإضافة إلى عيوب المذكورة أعلاه، فإنه من الصعب للغاية لاستعادة هياكل الخلية من الهلاميات المائية PEGDA نظرا لطبيعة التغاير وغير القابلة للتحلل، من شبكات crosslinked. في حين يمكن إدراج البروتيني حساسة الببتيداتفي العمود الفقري macromer PEG لتقديم خامل غير ذلك الهلاميات المائية PEGDA حساسة للانشقاق الأنزيمية، وغالبا ما يستخدم اقتران الكواشف باهظة الثمن وشبكات الناتجة لا تزال تحتوي على درجة عالية من عدم التجانس نظرا لطبيعة سلسلة البلمرة النمو. 13-15
في الآونة الأخيرة، وقد ثبت PEG-الببتيد الهلاميات المائية شكلت عبر بلمرة ضوئية المنشأ ثيول-إيني خطوة نمو لعرض خصائص تفضيلية لتغليف الخلايا على الهلاميات المائية التي شكلتها سلسلة النمو بلمرة ضوئية المنشأ. 7 وحركية الهلام متفوقة من ثيول-إيني الهلاميات المائية ويعزى إلى فوق " "طبيعة التفاعل بين ثيول وظائف إيني. مقارنة سلسلة البلمرة من النمو PEGDA، ثيول-إيني رد فعل أقل الأكسجين مما يؤدي إلى تثبيط معدل أسرع الهلام. 16،17 ثيول-إيني الهلاميات المائية أيضا أعلى كفاءة البلمرة وخصائص أفضل هلام البيوفيزيائية مقارنة الهلاميات المائية PEGDA سلسلة النمو، 7 ، 18 </ سوب> مما يؤدي إلى تلف الخلايا التي تسببها الأنواع محدودة جذرية خلال بلمرة ضوئية المنشأ.
سابقا، ثيول-إيني الهلاميات المائية التي شكلتها الذراع 4-macromer (PEG4NB) PEG-نوربورنين ومكرر السيستين الببتيد تحتوي على crosslinkers، مثل البروتياز حساسة استخدمت لتغليف الخلايا الببتيدات. 7،18 tunability العليا شبكات هيدروجيل يقدم PEG 3D المكروية مرنة ويمكن السيطرة عليها عن التحقيق في بقاء الخلية والنشاط، في حين أن استخدام البروتيني تراعي تسلسل الببتيد يوفر طريقة خفيفة لاسترداد بنيات الخلية تشكلت بشكل طبيعي داخل الهلاميات المائية. في هذا البروتوكول خطوة نستخدم النمو photopolymerized ثيول-إيني الهلاميات المائية ملفقة باستخدام الذراع 4-PEG-نوربورنين (PEG4NB) وcrosslinker الببتيد كيموتربسين حساسة (CGGY ↓ C) لتغليف الخلايا β MIN6. هذا البروتوكول بالتفصيل منهجية لدراسة تقنيات تشكيل البقاء، وانتشار كروي من MIN6β-cells في ثيول-إيني الهلاميات المائية. نحن نقدم طريقة لزيادة β خلايا الانتعاش كروي وتوصيف الأجسام الشبه الكروية البيولوجي للشفاء.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول وصف تفاصيل يعرض على تغليف سهلة من الخلايا في ثيول-إيني الهلاميات المائية التي شكلتها خطوة نمو بلمرة ضوئية المنشأ. في حين تم استخدام نسبة 1:1 من متكافئة من نوربورنين إلى المجموعات الوظيفية ثيول في هذا البروتوكول، يمكن تعديل نسبة اعتمادا على التجارب. بالإضاف…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R21EB013717) وIUPUI OVCR (RSFG). المؤلف يشكر السيدة هان شي لمساعدتها التقنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-arm PEG (20kDa) | Jenkem Technology USA | 4ARM-PEG-20K | |
| Fmoc-amino acids | Anaspec | ||
| Live/Dead cell viability kit | Invitrogen | L3224 | Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1 |
| AlamarBlue reagent | AbD Serotec | BUF012 | |
| CellTiter Glo reagent | Promega | G7570 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| HBSS | Lonza | 10547F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| High Glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | |
| Trypsin-free α-chymotrypsin | Worthington Biochemical Corp | LS001432 | |
| Mouse Inusin ELISA kit | Mercodia | 10-1247-01 | |
| 1 ml disposable syringe | BD biosciences |
Referências
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine. Pharmaceutical research. 26, 631-643 (2009).
- Lin, C. C., Metters, A. T. Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling. Advanced drug delivery reviews. 58, 1379-1408 (2006).
- Khetan, S., Burdick, J. A. Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions. Soft Matter. 7, 830-838 (2011).
- Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human neutrophil elastase responsive delivery from poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomacromolecules. 10, 1484-1489 (2009).
- Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled beta-cell microenvironments. Acta biomaterialia. 2, 1-8 (2006).
- Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids. Biomaterials. 32, 9685-9695 (2011).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Glucagon-like peptide-1 functionalized PEG hydrogels promote survival and function of encapsulated pancreatic beta-cells. Biomacromolecules. 10, 2460-2467 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Cell-cell communication mimicry with poly(ethylene glycol) hydrogels for enhancing beta-cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6380-6385 (2011).
- Hui, H., Nourparvar, A., Zhao, X., Perfetti, R. Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5′-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A- and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Endocrinology. 144, 1444-1445 (2003).
- Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. Journal of biomedical materials research. Part A. 90, 720-729 (2009).
- Weber, L. M., Hayda, K. N., Haskins, K., Anseth, K. S. The effects of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell function within hydrogels functionalized with matrix-derived adhesive peptides. Biomaterials. 28, 3004-3011 (2007).
- Hsu, C. W., Olabisi, R. M., Olmsted-Davis, E. A., Davis, A. R., West, J. L. Cathepsin K-sensitive poly(ethylene glycol) hydrogels for degradation in response to bone resorption. Journal of biomedical materials research. Part A. 98, 53-62 (2011).
- Leslie-Barbick, J. E., Moon, J. J., West, J. L. Covalently-immobilized vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell tubulogenesis in poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels. Journal of biomaterials science. Polymer. 20, 1763-1779 (2009).
- Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. Micropatterning of poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomolecules to regulate and guide endothelial morphogenesis. Tissue engineering. Part A. 15, 579-585 (2009).
- Hoyle, C. E., Bowman, C. N. Thiol-ene click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 1540-1573 (2010).
- Hoyle, C. E., Lowe, A. B., Bowman, C. N. Thiol-click chemistry: a multifaceted toolbox for small molecule and polymer synthesis. Chemical Society reviews. 39, 1355-1387 (2010).
- Fairbanks, B. D., et al. A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization. Adv. Mater. 21, 5005 (2009).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30, 6702-6707 (2009).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Characterization of protein release from hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogels. Biotechnology and bioengineering. 108, 197-206 (2011).
