O protocolo a seguir fornece técnicas para encapsular as células pancreáticas β na etapa de crescimento-PEG-péptido hidrogeles formados por reacções foto-clique tiol-eno. Esta plataforma de material não só proporciona um microambiente cytocompatible para encapsulamento de células, mas também permite que controlado pelo utilizador a recuperação rápida de estruturas de células formadas dentro dos hidrogéis.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Geração e recuperação de β-esferóides de células a partir do passo de crescimento-PEG-péptido Hidrogéis
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os hidrogéis são polímeros reticulados hidrófilos que proporcionam um microambiente tridimensional com tecido semelhante a elasticidade e permeabilidade elevada para a cultura de células ou tecidos terapeuticamente relevantes. Hidrogeles preparados a partir de poli (etileno glicol) (PEG), os derivados são cada vez mais utilizados para uma variedade de aplicações de engenharia de tecidos, em parte devido às suas propriedades e cytocompatible sintonizáveis. Neste protocolo, utilizamos tiol-eno etapa de crescimento photopolymerizations para fabricar PEG peptídeo-hidrogéis para encapsular pancreático MIN6 b-células. Os géis foram formadas por 4 braços PEG-norborneno macrómero (PEG4NB) e um agente de reticulação de péptidos quimotripsina-sensível (CGGYC). A natureza hidrófila e não-incrustante de PEG proporciona um microambiente cytocompatible para sobrevivência e proliferação celular em 3D, enquanto o uso de quimotripsina sensível sequência peptídica (C GGY ↓ C, seta indica local de clivagem da enzima, enquanto cisto terminaiseine resíduos foram adicionados por tiol-eno reticulação) permite uma recuperação rápida de estruturas celulares que formam dentro do hidrogel. O protocolo que se segue desenvolve técnicas para: (1) encapsulamento dos MIN6 β células-tiol-eno hidrogéis, (2) ensaios de viabilidade qualitativa e quantitativa de células para determinar a sobrevivência e proliferação das células, (3) A recuperação de esferóides de células usando quimotripsina mediada gel erosão, e (4) a análise estrutural e funcional dos esferóides recuperados.
Introdução
Hidrogéis são hidrofílicas polímeros reticulados com potencial excepcional como materiais de andaimes para reparar e regenerar os tecidos. 1-3 O alto teor de água de hidrogéis permite fácil difusão de oxigênio e troca de nutrientes e produtos metabólicos celulares, os quais são fundamentais para a manutenção da viabilidade celular. Além disso, os hidrogéis são excelentes veículos para a libertação controlada e distribuição das células, devido a sua alta tunability. Dois hidrogeles sintéticos tais como aqueles preparados a partir de poli (etileno glicol) (PEG) são cada vez mais utilizados em aplicações de engenharia de tecidos, em grande parte de....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
A. Macrómero e Peptide Synthesis
- Sintetizar quatro braço-PEG-norborneno (PEG4NB) e arylphosphanate fotoiniciador lítio (LAP), usando protocolos estabelecidos 18,19.
- Sintetizar bis-cisteína contendo quimotripsina sensível peptídeo CGGY ↓ C (seta indica quimotripsina local de clivagem) utilizando padrão de síntese de péptidos em fase sólida num sintetizador de péptidos de microondas (CEM Discover SPS).
- Calcula-se a quantidade de resina (Rink amida-resina MBHA) necessário com base na relação de substituição da resina e a escala de síntese. Inchar a resina no seio de dimetilformamida (DMF) num recipiente de reacção ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
As Figuras 1-4 mostram os resultados de sobrevivência representativos para a encapsulação, a proliferação, a formação de esferóides, e recuperação esferóide tiol-eno em hidrogéis. Figura 1 mostra o esquema da reacção de (1) um passo de crescimento de fotopolimerização tiol-eno usando PEG4NB e CGGYC, e ( 2) a quimotripsina erosão gel mediada que segue um mecanismo de erosão de superfície. Figuras 2 e 3 apresentam os resultados obtidos utilizando-se.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O protocolo descrito apresenta detalhes sobre a encapsulação de células simples em tiol-eno hidrogeles formados a passo de crescimento de fotopolimerização. Enquanto uma proporção estequiométrica de 1:1 de norborneno para grupos funcionais tiol foi utilizada neste protocolo, a razão pode ser ajustada de acordo com as experiências. Para além de uma formulação correcta, é importante para manter a homogeneidade da solução de pré-polímero. Em particular, a utilização de pipetagem suave para assegurar que as células são bem .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este projeto foi financiado pelo NIH (R21EB013717) e OVCR IUPUI (RSFG). O autor agradece a Sra. Han Shih por sua assistência técnica.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| 4 braço-PEG (20 kDa) | Jenkem Tecnologia EUA | 4ARM-PEG-20K | |
| Fmoc-aminoácidos | Anaspec | ||
| Vivo / Morto kit viabilidade celular | Invitrogen | L3224 | Inclui calceína AM e etídio homodímero-1 |
| Reagente AlamarBlue | Abd Serotec | BUF012 | |
| CellTiter reagente Glo | Promega | G7570 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | Sem Ca +2 e Mg +2 |
| HBSS | Lonza | 10547F | SemCa +2 e Mg +2 |
| Glicose alta DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Antibiótico-antimicótico | Invitrogen | 15240-062 | |
| β-mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ML | |
| Tripsina-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | |
| Tripsina-livre α-quimotripsina | Worthington Corp Bioquímica | LS001432 | |
| Rato Inusin ELISA kit | Mercodia | 10-1247-01 | |
| Uma seringa descartável ml | BD Biosciences |
Referências
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
