Geração e recuperação de β-esferóides de células a partir do passo de crescimento-PEG-péptido Hidrogéis
Summary
O protocolo a seguir fornece técnicas para encapsular as células pancreáticas β na etapa de crescimento-PEG-péptido hidrogeles formados por reacções foto-clique tiol-eno. Esta plataforma de material não só proporciona um microambiente cytocompatible para encapsulamento de células, mas também permite que controlado pelo utilizador a recuperação rápida de estruturas de células formadas dentro dos hidrogéis.
Abstract
Os hidrogéis são polímeros reticulados hidrófilos que proporcionam um microambiente tridimensional com tecido semelhante a elasticidade e permeabilidade elevada para a cultura de células ou tecidos terapeuticamente relevantes. Hidrogeles preparados a partir de poli (etileno glicol) (PEG), os derivados são cada vez mais utilizados para uma variedade de aplicações de engenharia de tecidos, em parte devido às suas propriedades e cytocompatible sintonizáveis. Neste protocolo, utilizamos tiol-eno etapa de crescimento photopolymerizations para fabricar PEG peptídeo-hidrogéis para encapsular pancreático MIN6 b-células. Os géis foram formadas por 4 braços PEG-norborneno macrómero (PEG4NB) e um agente de reticulação de péptidos quimotripsina-sensível (CGGYC). A natureza hidrófila e não-incrustante de PEG proporciona um microambiente cytocompatible para sobrevivência e proliferação celular em 3D, enquanto o uso de quimotripsina sensível sequência peptídica (C GGY ↓ C, seta indica local de clivagem da enzima, enquanto cisto terminaiseine resíduos foram adicionados por tiol-eno reticulação) permite uma recuperação rápida de estruturas celulares que formam dentro do hidrogel. O protocolo que se segue desenvolve técnicas para: (1) encapsulamento dos MIN6 β células-tiol-eno hidrogéis, (2) ensaios de viabilidade qualitativa e quantitativa de células para determinar a sobrevivência e proliferação das células, (3) A recuperação de esferóides de células usando quimotripsina mediada gel erosão, e (4) a análise estrutural e funcional dos esferóides recuperados.
Introduction
Hidrogéis são hidrofílicas polímeros reticulados com potencial excepcional como materiais de andaimes para reparar e regenerar os tecidos. 1-3 O alto teor de água de hidrogéis permite fácil difusão de oxigênio e troca de nutrientes e produtos metabólicos celulares, os quais são fundamentais para a manutenção da viabilidade celular. Além disso, os hidrogéis são excelentes veículos para a libertação controlada e distribuição das células, devido a sua alta tunability. Dois hidrogeles sintéticos tais como aqueles preparados a partir de poli (etileno glicol) (PEG) são cada vez mais utilizados em aplicações de engenharia de tecidos, em grande parte devido à sua cytocompatibility, tecido- como a elasticidade, e tunability elevado em material as propriedades físicas e mecânicas. 4-6
Apesar de uma plataforma de hidrogel de uso geral, os estudos mostraram que o PEG diacrilato (PEGDA) hidrogeles formados por cadeia de crescimento photopolymerizations têm uma tendência para danificar as células encapsuladas during reticulação da rede e na encapsulação de células in situ. 7 O dano celular foi largamente atribuída a espécies de radicais livres gerados pelas moléculas de fotoiniciador, que se propagam através dos grupos de vinil sobre PEGDA a cadeias de polímero em ligação cruzada de hidrogéis. Infelizmente, estas espécies radicalares também provocar tensões e danos celulares durante a encapsulação de células, especialmente para radical células sensíveis, tais como as células pancreáticas β. 8-10 De modo a obter um tamanho de malha maior para uma melhor difusão e sobrevivência celular, pesos moleculares mais elevados PEGDA são muitas vezes utilizados para a encapsulação de células. Isto, no entanto, compromete a cinética de polimerização e causa sub-óptimas propriedades de gel biofísicos. 7,11,12 Além das desvantagens acima mencionadas, é muito difícil recuperar as estruturas celulares a partir de hidrogéis PEGDA devido à natureza heterogeneidade e não degradável de as redes reticuladas. Enquanto protease sensíveis péptidos podem ser incorporadosem PEG backbone de macrómero para processar os hidrogéis de outro modo inertes PEGDA sensíveis à clivagem enzimática, a conjugação frequentemente utiliza reagentes dispendiosos e as redes resultantes contêm ainda elevado grau de heterogeneidade devido à natureza da cadeia de crescimento-polimerização. 13-15
Recentemente, o PEG-péptido hidrogeles formados via passo crescimento fotopolimerização-tiol-eno Foi demonstrado que exibem propriedades preferenciais para a encapsulação de células sobre hidrogeles formados por fotopolimerização cadeia crescimento. 7 A cinética de gelificação superiores de tiol-eno hidrogéis é atribuído ao clique " "natureza da reação entre o tiol e funcionalidades Ene. Em comparação com o crescimento da cadeia de polimerização de PEGDA, tiol-eno reacção é menos inibida de oxigénio o que resulta em taxas mais rápidas de gelificação. 16,17 tiol-eno hidrogeles também têm uma maior eficiência de polimerização e melhores propriedades biofísicas do gel comparado com o crescimento da cadeia-PEGDA hidrogéis, 7 , 18 </ Sup>, que resulta em dano celular limitada causada por espécies de radicais livres durante a fotopolimerização.
Anteriormente, tiol-eno hidrogéis formada por quatro braços-PEG-norborneno (PEG4NB) macrómero e de cisteína bis-reticuladores contendo péptidos, tais como a protease sensíveis péptidos têm sido utilizados para a encapsulação de células. Tunability 7,18 Alta de redes de hidrogel de PEG proporciona um flexível e controlável microambiente 3D para investigar a sobrevivência de células e de actividade, enquanto que a utilização de protease-sensitive sequência peptídica fornece uma forma suave para a recuperação de estruturas celulares formadas naturalmente dentro de hidrogéis. Neste protocolo, utilizamos passo crescimento fotopolimerizável tiol-eno hidrogéis fabricado usando 4-braço PEG-norborneno (PEG4NB) e um agente de reticulação de péptidos quimotripsina-sensível (CGGY ↓ C) para a encapsulação de células β MIN6. Este protocolo sistematicamente elabora técnicas para estudar a formação de proliferação, sobrevivência e esferóide de MIN6β células-tiol-eno hidrogeles. Nós ainda proporcionar um método para a recuperação de células β esferóide e caracterização biológica de esferóides recuperados.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito apresenta detalhes sobre a encapsulação de células simples em tiol-eno hidrogeles formados a passo de crescimento de fotopolimerização. Enquanto uma proporção estequiométrica de 1:1 de norborneno para grupos funcionais tiol foi utilizada neste protocolo, a razão pode ser ajustada de acordo com as experiências. Para além de uma formulação correcta, é importante para manter a homogeneidade da solução de pré-polímero. Em particular, a utilização de pipetagem suave para assegurar que…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projeto foi financiado pelo NIH (R21EB013717) e OVCR IUPUI (RSFG). O autor agradece a Sra. Han Shih por sua assistência técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-arm PEG (20kDa) | Jenkem Technology USA | 4ARM-PEG-20K | |
| Fmoc-amino acids | Anaspec | ||
| Live/Dead cell viability kit | Invitrogen | L3224 | Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1 |
| AlamarBlue reagent | AbD Serotec | BUF012 | |
| CellTiter Glo reagent | Promega | G7570 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| HBSS | Lonza | 10547F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| High Glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | |
| Trypsin-free α-chymotrypsin | Worthington Biochemical Corp | LS001432 | |
| Mouse Inusin ELISA kit | Mercodia | 10-1247-01 | |
| 1 ml disposable syringe | BD biosciences |
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