Cryosectioning קהילות שמרים לבחינת דפוסי פלואורסצנטי
Summary
אנו מציגים פרוטוקול להקפאה וcryosectioning קהילות שמרים להתבונן דפוסים הפנימיים של תאי ניאון. השיטה מסתמכת על מתנול, תיקון ואוקטובר הטבעה-לשמר את הפיזור המרחבי של תאים ללא inactivating חלבוני ניאון בתוך קהילה.
Abstract
חיידקים בדרך כלל לגור ביישובים. הארגון המרחבי של תאים בתוך קהילה הוא האמין כדי להשפיע על ההישרדות והתפקוד של הקהילה 1. שיטות אופטיות, כולל חתך מיקרוסקופיה confocal ושני פוטונים, הוכיחו שימושיות להתבוננות ארגון המרחבי של קהילות חיידקים וarchaeal 2,3. שילוב של הדמית confocal וחתך פיזי של מושבות שמרים חשף ארגון הפנימי של תאים 4. עם זאת, חתך אופטי ישיר באמצעות מיקרוסקופיה confocal או שני פוטונים הצליח רק להגיע לכמה שכבות תאים עמוקים לתוך מושבות שמרים. מגבלה זו עשויה בגלל פיזור אור חזק מתאי שמרים 4.
כאן, אנו מציגים שיטה המבוססת על התיקון וcryosectioning להשיג פיזור המרחבי של תאי ניאון בתוך קהילות cerevisiae Saccharomyces. אנו משתמשים במתנול כסוכן מקבעכדי לשמר את הפריסה המרחבית של תאים. קהילות קבועות הם הסתננו עם מתחם אוקטובר, קפוא, וcryosectioned בcryostat. דימות פלואורסצנטי מהסעיפים חושפת את הארגון הפנימי של תאי ניאון בקהילה.
דוגמאות לקהילות שמרים הכוללות זנים המבטאים חלבוני ניאון אדומים וירוקים מדגימות את הפוטנציאל של שיטת cryosectioning כדי לחשוף את הפיזור המרחבי של תאי ניאון כמו גם זה של ביטוי גנים במושבות שמרים 2,3. למרות ההתמקדות שלנו הייתה בקהילות cerevisiae Saccharomyces, באותה השיטה יכולה באופן פוטנציאלי להיות מיושמת לבחון קהילות חיידקים אחרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההליך שהוצג כאן מציע דרך כדי להתבונן במבנה הפנימי של קהילות שמרים. צעד קיבוע מתנול הופך את מושבת השמרים נוקשה 8 ושומר על שלמותה של המושבה, ואולם, הוא גם גורם להתכווצות 8 שצריכים להילקח בחשבון בלפרש את התוצאות. אנחנו בדרך כלל רואים סביב 30% התכווצות בגובה של מ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו רוצים להודות ליונתן קופר מעבדה בפרד האצ'ינסון לחקר הסרטן לרשות להשתמש cryostat. עבודה זו נתמכה על ידי NIH וקק WM קרן. BM הוא עמית גורדון ובטי מור של קרן לחקר מדעי חיים. אנו מודים לדניאל Gottschling הפרוטוקול לשיתוף קיבועו איתנו.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
| Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | Leica | CM 1510 S |
Referências
- Tolker-Nielsen, T., Molin, S. Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities. Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).
- Moller, S., et al. In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members. Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).
- Lepp, P. W., et al. Methanogenic Archaea and human periodontal disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).
- Váchová, L., et al. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).
- Mináriková, L., et al. Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies. Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).
- Shou, W., et al. Synthetic cooperation in engineered yeast populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).
- Momeni, B., et al. Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities. , (2012).
- Kiernan, J., ed, . Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. , 4 (2008).
- Piccirillo, S., et al. The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies. Genética. 184 (3), 707-716 (2010).
