Непрерывная высокого разрешения Микроскопическое исследование репликативного старения у почкующихся дрожжей
Summary
Здесь мы опишем работу микрофлюидном устройство, которое позволяет непрерывно и с высоким разрешением микроскопическое изображение одного перспективных дрожжевых клеток во время их полного репликативной и / или хронологической продолжительности жизни.
Abstract
Мы демонстрируют использование простого Микрожидкостных установки, в которых один перспективных дрожжевых клеток можно проследить на протяжении всей своей жизни. Микрофлюидный чип использует размер разницы между матерью и дочерью клетки с использованием массива micropads. После загрузки, клетки в ловушке под этими micropads, поскольку расстояние между MicroPad и покровным стеклом похожа на диаметр дрожжевой клетки (3-4 мкм). После процедуры загрузки, культуры среда непрерывно пропускают через чип, который не только создает постоянный и определенной среде на протяжении всего эксперимента, но и вымывает новые дочерние клетки, которые не сохраняются под колодки из-за их меньшего размера. Установка сохраняет материнских клеток настолько эффективно, что в одном эксперименте до 50 отдельных клеток можно контролировать в полностью автоматическом режиме в течение 5 дней или, если необходимо, дольше. Кроме того, отличные оптические свойства микросхемы обеспечивают высокуюРазрешающая способность клеток в течение всего процесса старения.
Introduction
Почкующихся дрожжей является важной моделью для организма старение исследования 1. До недавнего времени изучение репликативного старения в клетках дрожжей не было трудоемкий процесс, требующий вскрытия методом, в котором каждая почка не удалены вручную из материнской клетки 2,3. Чтобы решить эту проблему, мы недавно представили новую установку микрожидкостной возможность отслеживать отдельные клетки матери на протяжении всей своей жизни 4.
В нашем микрофлюидный чип, дрожжевые клетки оказались в ловушке под мягкие на основе эластомеров micropads (см. Рисунок 1). Непрерывный поток среднего смывает новообразованных дочерних клеток и обеспечивает клетки со свежими питательные вещества. В одном эксперименте, до 50 материнские клетки можно наблюдать в полностью автоматическом режиме на протяжении всего их репликативной продолжительности жизни. В связи с превосходными оптическими свойствами микрофлюидного чипа, можно одновременно контролировать различные аспекты биологии клетки дрожжей (например, </EM> с помощью флуоресцентных белков).
По сравнению с классическим методом вскрытия, микрожидкостной установки обеспечивает существенные преимущества. Это обеспечивает определенную и постоянную среду в течение всего эксперимента старения. Она не требует дорогого специализированного оборудования и может быть запущен на любой микроскоп оснащен автоматизированной фокус и покадровой способностей, а также контроля температуры для выращивания клеток. Производства и эксплуатации микрожидкостных чипов можно узнать в течение нескольких дней. Кроме того, клетки могут быть непосредственно загружены с экспоненциально растущей культуры, преимущество над другими недавно опубликованных Микрожидкостных методу 5, который требует биотинилирования материнских клеток. В сочетании с высоким разрешением, описанные здесь способ может быть использован для измерения постепенных изменений в клеточной морфологии, экспрессии белка и локализация во время старения дрожжей беспрецедентным образом. Способность кдолгосрочный мониторинг отдельных клеток также предоставляет уникальные возможности для исследования дрожжей клеточного цикла.
Этот метод в последнее время были оптимизированы, чтобы удалить биотинилированием из протокола 16, который был опубликован в то время как эта рукопись была в обзоре.
Protocol
Representative Results
Discussion
Микрожидкостных метод, описанный здесь является важным инструментом романа в исследовании старения, поскольку позволяет простой и автоматизированной генерации дрожжей репликативное данные продолжительности жизни в сочетании с непрерывным высоким разрешением. Эти атрибуты являютс…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Лору Schippers для написания первой версии протокола нагрузки сотовой ячейки и Маркус де Goffau и Guille Zampar тестов митохондриальной морфологии.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomer | Mavom bv | 1060040 | This package contains PDMS base and PDMS curing agent. |
| Glass Petri dishes 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Cover glasses 22×40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Aluminum foil | |||
| Plastic disposable cup | |||
| Serological pipette 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Scotch tape | VWR International | 819-1460 | |
| Baysilone paste (GE Bayer silicones) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| PTFE microbore tubing, 0.012″ID x 0.030″OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Referred to as thin tubing |
| Tygon microbore Tubing, 0.030″ID x 0.090″OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Referred to as thick tubing |
| Scalpel | VWR International | 233-5334 | |
| 50 ml Luer-Lok syringes | BD | 300137 | |
| 5 ml syringes, Luer tip | VWR International | 613-1599 | |
| Tweezers | VWR International | 232-2132 | |
| 20 Gauge Luer stubs | Instech Solomon | LS20 | |
| Syringe filters (pore size 0.20 μm) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Petri dishes | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop UV-Ozone Cleaner | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| SU-8 silicon master mold (wafer) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Desiccator | VWR International | 467-2115 | |
| Hot plate | VWR International | 460-3267 | |
| Optional: Metal holder for cover glass (22×40 mm) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| (Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage | Nikon | Eclipse Ti-E |
Referências
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. Using yeast to discover the fountain of youth. Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1 (2001).
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. J. Vis. Exp. (28), e1209 (2009).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. , (2012).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
- Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging. J. Vis. Exp. (58), e3297 (2011).
- Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).
- Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).
- Defossez, P. A., et al. Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells. Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms. Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).
- Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding. Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).
- Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).
- Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
- Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).
