Isolatie en Kv Channel Opnamen in Murine atriale en ventriculaire cardiomyocyten
Summary
Kv dysfunctie wordt geassocieerd met hartritmestoornissen. Om de moleculaire mechanismen die leiden tot dergelijke aritmieën we een systematische protocol gebruiken voor isolatie van atriale en ventriculaire hartspiercellen uit Kv kanaal bijkomende subunit knockout muizen. Geïsoleerde cardiomyocyten kan vervolgens direct worden gebruikt voor cellulaire elektrofysiologische studies, biochemische of immunofluorescentie (IF) testen.
Abstract
KCNE genen coderen voor een kleine familie van Kv kanalen bijkomende subeenheden die heteromere complexen met Kv kanalen alfa subeenheden vormen om hun functionele eigenschappen te wijzigen. Mutaties in KCNE genen zijn gevonden in patiënten met hartritmestoornissen zoals lange QT syndroom en / of atriale fibrillatie. De precieze moleculaire pathofysiologie die leidt tot die ziekten nog onduidelijk. In eerdere studies de elektrofysiologische eigenschappen van de ziekte veroorzakende mutaties in deze genen zijn meestal onderzocht in heterologe expressie systemen en we kunnen niet zeker of de gerapporteerde effecten kunnen direct worden vertaald in de moedertaal van hartspiercellen. In ons laboratorium hebben we daarom gebruik maken van een andere aanpak. Wij direct de effecten van KCNE gendeletie in geïsoleerde cardiomyocyten van knockout muizen door cellulaire elektrofysiologie – een unieke techniek die we beschrijven in dit nummer van het Journal of Gevisualiseerd Experimenten. De harten van genetically ontworpen KCNE muizen snel uitgesneden en gemonteerd op een Langendorff-apparaat door aorta canule. Vrije Ca2 + in het myocardium is gebonden EGTA en dissociatie van cardiomyocyten wordt dan bereikt door retrograde perfusie van de kransslagaders met een speciale laag Ca 2 + buffer met collagenase. Atria, vrije rechter ventrikel wand en het linker ventrikel kan dan worden gescheiden door microchirurgische technieken. Calcium wordt vervolgens langzaam toegevoegd naar geïsoleerde cardiomyocyten in meerdere stappen omvattende wassen. Atriale en ventriculaire hartspiercellen gezonde uiterlijk zonder spontane contracties worden dan onmiddellijk onderworpen aan analyses door elektrofysiologische patch clamp techniek of andere biochemische analyses binnen de eerste 6 uur na isolatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met de groeiende ontwikkeling van genetisch gemanipuleerde muizenstammen de hartfunctie en cardiale pathologie over gendeletie bestuderen er ook een toenemende belangstelling voor gespecialiseerde methoden om de effecten van het specifieke gen deletie in vitro bestuderen. In ons laboratorium bestuderen we de rol van een familie van Kv kanalen bijkomende subeenheden op de cardiale repolarisatie. De KCNE genen bestaan uit een gezin van 5 genen (KCNE1-5) die een belangrijke rol in de mensel…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door subsidies van Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Fritz-Thyssen-Stiftung en Charite / MDC.
Materials
| Name of the Reagent | Company |
| Tetrodotoxin | Alomone |
| 4-aminopyridine | ICN Biomedicals |
| Heteropodatoxin 2 | Alomone |
| Tetraethylammonium | Sigma Chemicals |
| Collagenase Type 2 | Worthington |
Referências
- Abbott, G. W., Goldstein, S. A., Sesti, F. Do all voltage-gated potassium channels use MiRPs?. Circ. Res. 88, 981-983 (2001).
- Abbott, G. W., Sesti, F., Splawski, I., Buck, M. E., Lehmann, M. H., Timothy, K. W., Keating, M. T., Goldstein, S. A. MiRP1 forms IKr potassium channels with HERG and is associated with cardiac arrhythmia. Cell. 97, 175-187 (1999).
- Barry, D. M., Trimmer, J. S., Merlie, J. P., Nerbonne, J. M. Differential expression of voltage-gated K+ channel subunits in adult rat heart. Relation to functional K+ channels?. Circ. Res. 77, 361-369 (1995).
- Benjamin, E. J., Wolf, P. A., D’Agostino, R. B., Silbershatz, H., Kannel, W. B., Levy, D. Impact of atrial fibrillation on the risk of death: the Framingham Heart Study. Circulation. 98, 946-952 (1998).
- Bou-Abboud, E., Nerbonne, J. M. Molecular correlates of the calcium-independent, depolarization-activated K+ currents in rat atrial myocytes. J. Physiol. 517 (Pt 2), 407-420 (1999).
- Gaborit, N., Steenman, M., Lamirault, G., Le, M. N., Le, B. S., Lande, G., Leger, J., Charpentier, F., Christ, T., Dobrev, D., Escande, D., Nattel, S., Demolombe, S. Human atrial ion channel and transporter subunit gene-expression remodeling associated with valvular heart disease and atrial fibrillation. Circulation. 112, 471-481 (2005).
- Guo, W., Xu, H., London, B., Nerbonne, J. M. Molecular basis of transient outward K+ current diversity in mouse ventricular myocytes. J. Physiol. 521 (Pt 3), 587-599 (1999).
- Lundby, A., Ravn, L. S., Svendsen, J. H., Hauns, S., Olesen, S. P., Schmitt, N. KCNE3 mutation V17M identified in a patient with lone atrial fibrillation. Cell Physiol. Biochem. 21, 47-54 (2008).
- Ma, K. J., Li, N., Teng, S. Y., Zhang, Y. H., Sun, Q., Gu, D. F., Pu, J. L. Modulation of KCNQ1 current by atrial fibrillation-associated KCNE4 (145E/D) gene polymorphism. Chin Med. J. (Engl.). 120, 150-154 (2007).
- McCrossan, Z. A., Abbott, G. W. The MinK-related peptides. Neuropharmacology. 47, 787-821 (2004).
- Pongs, O., Schwarz, J. R. Ancillary subunits associated with voltage-dependent K+ channels. Physiol. Rev. 90, 755-796 (2010).
- Ravn, L. S., Aizawa, Y., Pollevick, G. D., Hofman-Bang, J., Cordeiro, J. M., Dixen, U., Jensen, G., Wu, Y., Burashnikov, E., Haunso, S., Guerchicoff, A., Hu, D., Svendsen, J. H., Christiansen, M., Antzelevitch, C. Gain of function in IKs secondary to a mutation in KCNE5 associated with atrial fibrillation. Heart Rhythm. 5, 427-435 (2008).
- Ravn, L. S., Hofman-Bang, J., Dixen, U., Larsen, S. O., Jensen, G., Haunso, S., Svendsen, J. H., Christiansen, M. Relation of 97T polymorphism in KCNE5 to risk of atrial fibrillation. Am. J. Cardiol. 96, 405-407 (2005).
- Roepke, T. K., Abbott, G. W. Pharmacogenetics and cardiac ion channels. Vascul. Pharmacol. 44, 90-106 (2006).
- Roepke, T. K., Kontogeorgis, A., Ovanez, C., Xu, X., Young, J. B., Purtell, K., Goldstein, P. A., Christini, D. J., Peters, N. S., Akar, F. G., Gutstein, D. E., Lerner, D. J., Abbott, G. W. Targeted deletion of kcne2 impairs ventricular repolarization via disruption of I(K,slow1) and I(to,f). FASEB J. 22, 3648-3660 (2008).
- Sesti, F., Abbott, G. W., Wei, J., Murray, K. T., Saksena, S., Schwartz, P. J., Priori, S. G., Roden, D. M., George, A. L., Goldstein, S. A. A common polymorphism associated with antibiotic-induced cardiac arrhythmia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10613-10618 (2000).
- Temple, J., Frias, P., Rottman, J., Yang, T., Wu, Y., Verheijck, E. E., Zhang, W., Siprachanh, C., Kanki, H., Atkinson, J. B., King, P., Anderson, M. E., Kupershmidt, S., Roden, D. M. Atrial fibrillation in KCNE1-null mice. Circ. Res. 97, 62-69 (2005).
- Yang, Y., Xia, M., Jin, Q., Bendahhou, S., Shi, J., Chen, Y., Liang, B., Lin, J., Liu, Y., Liu, B., et al. Identification of a KCNE2 gain-of-function mutation in patients with familial atrial fibrillation. Am. J. Hum. Genet. 75, 899-905 (2004).
- Zeng, Z. Y., Pu, J. L., Tan, C., Teng, S. Y., Chen, J. H., Su, S. Y., Zhou, X. Y., Zhang, S., Li, Y. S., Wang, F. Z., et al. [The association of single nucleotide polymorphism of slow delayed rectifier K+ channel genes with atrial fibrillation in Han nationality Chinese]. Zhonghua Xin. Xue. Guan. Bing. Za Zhi. 33, 987-991 (2005).
- Zhang, M., Jiang, M., Tseng, G. N. minK-related peptide 1 associates with Kv4.2 and modulates its gating function: potential role as beta subunit of cardiac transient outward channel? Circ. Circ. Res. 88, 1012-1019 (2001).
