Выделение и записи Kv канала в мышиной предсердий и желудочков кардиомиоцитов
Summary
Kv канала дисфункции связаны с нарушениями ритма сердца. С целью изучения молекулярных механизмов, которые приводят к таким аритмии мы используем систематическое протокол для изоляции предсердий и желудочков кардиомиоциты от Kv канала мышей вспомогательные подразделения нокаутом. Изолированные кардиомиоциты могут быть немедленно использованы для сотовых электрофизиологических исследований, биохимических или иммунофлюоресценции (ИФ) анализы.
Abstract
KCNE гены кодируют для небольшой семьи из Kv канала вспомогательные подразделения, которые образуют комплексы с гетеромерных Kv канала альфа-субъединицы для изменения их функциональных свойств. Мутации в генах KCNE были обнаружены у пациентов с сердечной аритмии, такие как синдром удлиненного QT и / или фибрилляции предсердий. Тем не менее, точные молекулярные патофизиологии, что приводит к таким заболеваниям остается неуловимым. В предыдущих исследованиях электрофизиологических свойств болезнетворные мутации в этих генах в основном были изучены в гетерологичных системы экспрессии и мы не можем быть уверены, что если сообщила эффекты могут быть непосредственно переведены на родной кардиомиоцитов. В нашей лаборатории, мы используем другой подход. Мы непосредственно изучить влияние делеции гена KCNE в изолированных кардиомиоцитов из нокаутных мышей сотовой электрофизиологии – уникальный метод, который мы опишем в этом номере журнала Визуализированные эксперименты. Сердца от генетикаLLY инженерии мышей KCNE быстро вырезали и установлен на аппарате Лангендорфа путем катетеризации аорты. Бесплатные Ca 2 + в миокарде связана EGTA, и диссоциации кардиомиоцитов затем достигается ретроградной перфузии коронарных артерий со специализированным низким Ca 2 + буфер, содержащий коллагеназы. Atria, бесплатно стенки правого желудочка и левого желудочка могут быть отделены друг от микрохирургической техники. Кальций затем медленно добавляют обратно в изолированном кардиомиоцитов в нескольких шаг содержащие процедуры промывки. Предсердий и желудочков кардиомиоцитов здоровый вид, не спонтанное схватки сразу же подвергается анализу электрофизиологических патчем техника зажима или других биохимических анализов в течение первых 6 часов после изоляции.
Protocol
Representative Results
Discussion
С ростом развития генно-инженерных мышей штаммов для изучения функции сердца и сердечной патологии, связанные с удалением гена есть также возрастающий интерес в специализированных методов для изучения последствий конкретных делеции гена в лабораторных условиях. В нашей лаборат…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась за счет грантов от Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Фриц Тиссен-и-Stiftung Charité / MDC.
Materials
| Name of the Reagent | Company |
| Tetrodotoxin | Alomone |
| 4-aminopyridine | ICN Biomedicals |
| Heteropodatoxin 2 | Alomone |
| Tetraethylammonium | Sigma Chemicals |
| Collagenase Type 2 | Worthington |
Referências
- Abbott, G. W., Goldstein, S. A., Sesti, F. Do all voltage-gated potassium channels use MiRPs?. Circ. Res. 88, 981-983 (2001).
- Abbott, G. W., Sesti, F., Splawski, I., Buck, M. E., Lehmann, M. H., Timothy, K. W., Keating, M. T., Goldstein, S. A. MiRP1 forms IKr potassium channels with HERG and is associated with cardiac arrhythmia. Cell. 97, 175-187 (1999).
- Barry, D. M., Trimmer, J. S., Merlie, J. P., Nerbonne, J. M. Differential expression of voltage-gated K+ channel subunits in adult rat heart. Relation to functional K+ channels?. Circ. Res. 77, 361-369 (1995).
- Benjamin, E. J., Wolf, P. A., D’Agostino, R. B., Silbershatz, H., Kannel, W. B., Levy, D. Impact of atrial fibrillation on the risk of death: the Framingham Heart Study. Circulation. 98, 946-952 (1998).
- Bou-Abboud, E., Nerbonne, J. M. Molecular correlates of the calcium-independent, depolarization-activated K+ currents in rat atrial myocytes. J. Physiol. 517 (Pt 2), 407-420 (1999).
- Gaborit, N., Steenman, M., Lamirault, G., Le, M. N., Le, B. S., Lande, G., Leger, J., Charpentier, F., Christ, T., Dobrev, D., Escande, D., Nattel, S., Demolombe, S. Human atrial ion channel and transporter subunit gene-expression remodeling associated with valvular heart disease and atrial fibrillation. Circulation. 112, 471-481 (2005).
- Guo, W., Xu, H., London, B., Nerbonne, J. M. Molecular basis of transient outward K+ current diversity in mouse ventricular myocytes. J. Physiol. 521 (Pt 3), 587-599 (1999).
- Lundby, A., Ravn, L. S., Svendsen, J. H., Hauns, S., Olesen, S. P., Schmitt, N. KCNE3 mutation V17M identified in a patient with lone atrial fibrillation. Cell Physiol. Biochem. 21, 47-54 (2008).
- Ma, K. J., Li, N., Teng, S. Y., Zhang, Y. H., Sun, Q., Gu, D. F., Pu, J. L. Modulation of KCNQ1 current by atrial fibrillation-associated KCNE4 (145E/D) gene polymorphism. Chin Med. J. (Engl.). 120, 150-154 (2007).
- McCrossan, Z. A., Abbott, G. W. The MinK-related peptides. Neuropharmacology. 47, 787-821 (2004).
- Pongs, O., Schwarz, J. R. Ancillary subunits associated with voltage-dependent K+ channels. Physiol. Rev. 90, 755-796 (2010).
- Ravn, L. S., Aizawa, Y., Pollevick, G. D., Hofman-Bang, J., Cordeiro, J. M., Dixen, U., Jensen, G., Wu, Y., Burashnikov, E., Haunso, S., Guerchicoff, A., Hu, D., Svendsen, J. H., Christiansen, M., Antzelevitch, C. Gain of function in IKs secondary to a mutation in KCNE5 associated with atrial fibrillation. Heart Rhythm. 5, 427-435 (2008).
- Ravn, L. S., Hofman-Bang, J., Dixen, U., Larsen, S. O., Jensen, G., Haunso, S., Svendsen, J. H., Christiansen, M. Relation of 97T polymorphism in KCNE5 to risk of atrial fibrillation. Am. J. Cardiol. 96, 405-407 (2005).
- Roepke, T. K., Abbott, G. W. Pharmacogenetics and cardiac ion channels. Vascul. Pharmacol. 44, 90-106 (2006).
- Roepke, T. K., Kontogeorgis, A., Ovanez, C., Xu, X., Young, J. B., Purtell, K., Goldstein, P. A., Christini, D. J., Peters, N. S., Akar, F. G., Gutstein, D. E., Lerner, D. J., Abbott, G. W. Targeted deletion of kcne2 impairs ventricular repolarization via disruption of I(K,slow1) and I(to,f). FASEB J. 22, 3648-3660 (2008).
- Sesti, F., Abbott, G. W., Wei, J., Murray, K. T., Saksena, S., Schwartz, P. J., Priori, S. G., Roden, D. M., George, A. L., Goldstein, S. A. A common polymorphism associated with antibiotic-induced cardiac arrhythmia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10613-10618 (2000).
- Temple, J., Frias, P., Rottman, J., Yang, T., Wu, Y., Verheijck, E. E., Zhang, W., Siprachanh, C., Kanki, H., Atkinson, J. B., King, P., Anderson, M. E., Kupershmidt, S., Roden, D. M. Atrial fibrillation in KCNE1-null mice. Circ. Res. 97, 62-69 (2005).
- Yang, Y., Xia, M., Jin, Q., Bendahhou, S., Shi, J., Chen, Y., Liang, B., Lin, J., Liu, Y., Liu, B., et al. Identification of a KCNE2 gain-of-function mutation in patients with familial atrial fibrillation. Am. J. Hum. Genet. 75, 899-905 (2004).
- Zeng, Z. Y., Pu, J. L., Tan, C., Teng, S. Y., Chen, J. H., Su, S. Y., Zhou, X. Y., Zhang, S., Li, Y. S., Wang, F. Z., et al. [The association of single nucleotide polymorphism of slow delayed rectifier K+ channel genes with atrial fibrillation in Han nationality Chinese]. Zhonghua Xin. Xue. Guan. Bing. Za Zhi. 33, 987-991 (2005).
- Zhang, M., Jiang, M., Tseng, G. N. minK-related peptide 1 associates with Kv4.2 and modulates its gating function: potential role as beta subunit of cardiac transient outward channel? Circ. Circ. Res. 88, 1012-1019 (2001).
