Маркировка отдельных клеток в центральной нервной системе<em> Дрозофилы</em

Summary

Мы представляем технику для маркировки отдельных нейронов в центральной нервной системе (ЦНС)<em> Drosophila</em> Эмбрионов, которая позволяет проводить анализ морфологии нейронов либо проходящем свете или конфокальной микроскопии.

Abstract

В этой статье мы расскажем, как индивидуально маркировать нейронов в ЦНС эмбриональные дрозофилы по juxtacellular введения липофильных флуоресцентных маркеров DiI мембраны. Этот метод позволяет визуализировать морфологию клеток нейронов в мельчайших подробностях. Можно пометить любую ячейку в ЦНС: клеточных тел нейронов-мишеней визуализируются при DIC оптики или выражение флуоресцентные генетических маркеров, таких как GFP. После маркировки, DiI может быть преобразована в постоянный коричневое пятно на фотопреобразования, чтобы позволить визуализации морфологии клеток в проходящем свете и DIC оптики. Кроме того, DiI-меченых клеток можно наблюдать непосредственно с конфокальной микроскопии, позволяющий генетически введен флуоресцентных белков репортер, чтобы быть colocalised. Этот метод может быть использован в любое животное, независимо от генотипа, что делает его возможным для анализа мутантных фенотипов на одной резолюции клетки.

Introduction

Знание морфологии нейронов на уровне отдельных клеток является ключевым условием для понимания нейронных соединений и ЦНС функции. Таким образом, с первых дней неврологии, исследователи стремились развивать одну ячейку маркировка техники (см. ⁷ для исторических лечения этого вопроса). Классические методы, такие как окрашивание Гольджи обеспечивают превосходное разрешение морфологии нейронов, но не подходит, если один пытается маркировать определенный тип нейронов в направленном образом, как окрашивание происходит случайным образом. Разработка методов окрашивания отдельных клеток или внутриклеточных juxtacellular введения красителей из микроэлектродов обратился к требованиям конкретной маркировки.

Применение однократной инъекции нейрона красителя Drosophila представлены основные проблемы, из-за малого размера и организм и его нейронов. Тем не менее, одно окрашивание нейронов эмбрионального Drosophila </em> Нейроны были достигнуты в середине 1980-х годов в лаборатории Кори Гудман ^15. Хотя метод был высшей полезно и предоставило некоторые ключевые идеи в механизмах нейронального развития у дрозофилы в течение последних 20-30 лет ^{(2, например, 10),} многие рабочие уклонялись от этого, в основном из-за его технических требований.

Наличие в последние годы генетические методы для маркировки нейронов дрозофилы также способствовало непопулярности одной инъекцией красителя нейрона. GAL4-направленной экспрессии мембранных ориентированных конструкций GFP может обеспечить превосходное разрешение нейронной морфологии ^{1, 20.} Однако, этот метод имеет некоторые ограничения: часто неизбежны выражения GFP в несколько ячеек можно скрыть структуру отдельных нейронов и GAL4 драйвер линии могут быть доступны не ездить выражение в конкретных нейронов интерес. MARCM (Mosaic анализ с Repressible Маркер Cell) метод ⁸ может обеспечить маркировку практически любого нейрона на уровне отдельной клетки, но не может быть успешно использован в зародыше и в начале личинки из-за медленного оборота GAL80 белка.

Учитывая эти ограничения генетической маркировки, мы считаем, что однократное введение красителя нейронов у эмбрионов Drosophila остается ценной техники и заслуживает более широкого применения. Для продвижения этой цели, мы предоставляем здесь подробное описание метода. Иллюстрация из его питание обеспечивается нашей недавней счет морфологии полный набор интернейроны в брюшной neuromeres конца эмбриона Drosophila ^14. Это исследование, которое показало, как морфологической изменчивости отдельных нейронов типов клеток и принципы организации neuromere в ЦНС эмбриона, не были бы возможны с любым другим в настоящее время маркировки методом.

Protocol

Мы использовали два несколько разных вариантов одного метода маркировки нейронов в наших лабораториях. Различия касаются эмбрионов, dechorionisation, devitellinisation и шаги эмбриона филе. Рисунок 1 дает обзор общих и расходящиеся шагов из вариантов. 1. Подготовка микро-иглы дл…

Representative Results

На рисунке 4 показаны типичные результаты технику, мы опишем здесь. Рисунке 4а приведен пример DiI заполнены одной интернейронов, который был чисто photoconverted. Это хорошо демонстрирует степень детализации этих препаратов предложение. При осмотре под DIC оптики пространств?…

Discussion

Одно из главных преимуществ Drosophila в качестве модельной системы является то, что она позволяет анализ развития и функционирования на уровне отдельных клеток. Это особенно полезно в отношении нервной системы, где разнообразие типов клеток является исключительно высоким и функции ?…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
			REAGENTS
DAB	Sigma-Aldrich	D-5905	2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4
DiI	Invitrogen/Molecular Probes	D-282	1 mg/ml in ethanol
Formaldehyde	Merck Millipore		7,4 % in PBS
Glycerol	Roth	3783	70% in PBS
Heptane Glue	Beiersdorf AG	Cello 31-39-30 *	dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane
PBS			1x
TRIS	Roth	4855
Vectashield	Vector Laboratories	H1000
			EQUIPMENT
Confocal Microscope	Leica	TCS SP2	to view and document labelings in fluorescence
DC – amplifier	Dragan Corporation	Cornerstone ION-100	to perform the labelings
Coverslips	Menzel	BB018018A1	18 x 18 mm
Coverslips	Menzel	BB024060A1	24 x 60 mm
Dissecting Microscope	Leica	MZ8	to prepare and disect embryos
Flat Capillaries	Hilgenberg		outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm
Injection Capillaries	Science Products	GB 100 TF 8P
Micromanipulator R	Leica		to perform the labelings
Model P-97	Sutter Instruments		to pull capillaries
Object Slides	Marienfeld Superior	1000000
Scientific Microscope	Zeiss	Axioskop 2 mot	to view labelings after photoconversion
Scientific Microscope	Olympus	BX50	to perform the labelings
Sony MC3255 Video Camera	Sony/AVT Horn	Sony MC3255	to record labelings after photoconversion

Table 1.