अलगाव और संस्कृति नवजात माउस cardiomyocytes की
Summary
प्राथमिक माउस cardiomyocyte संस्कृतियों myofibrillar संगठन और समारोह की जांच के लिए निर्णायक उपकरणों में से एक हैं. निम्नलिखित प्रोटोकॉल नवजात माउस दिल से प्राथमिक cardiomyocytes के अलगाव और संस्कृति का वर्णन करता है. परिणामस्वरूप cardiomyocyte संस्कृतियों बाद में biomechanical, जैव रासायनिक और सेल जैविक assays की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
संवर्धित नवजात cardiomyocytes लंबे myofibrillogenesis और myofibrillar कार्यों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. संवर्धित cardiomyocytes आसान जांच और हेरफेर जैव रासायनिक रास्ते की, और अनायास cardiomyocytes पिटाई के biomechanical संपत्तियों पर उनके प्रभाव के लिए अनुमति देते हैं.
निम्नलिखित 2 दिन प्रोटोकॉल नवजात माउस cardiomyocytes के अलगाव और संस्कृति का वर्णन करता है. हम आसानी से, नवजात शिशुओं से दिल टुकड़े करना हृदय के ऊतकों को अलग कर देना और हृदय सेल आबादी से cardiomyocytes को समृद्ध करने के लिए दिखा. हम सेल हदबंदी के लिए अलग एंजाइम घोला जा सकता है के उपयोग, और सेल व्यवहार्यता पर उनके प्रभाव पर चर्चा की. पृथक cardiomyocytes बाद में रूपात्मक, electrophysiological, जैव रासायनिक, सेल जैविक या biomechanical assays के एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम केवल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध समाधान का उपयोग करके, मजबूती और reproducibility के लिए प्रोटोकॉल अनुकूलित और एंजाइम घोला जा सकता है कि शओउ थोड़ा बहुत से बहुत परिवर्तनशीलता. हम भी cardiomyocytes के अलगाव और संस्कृति के साथ जुड़े आम समस्याओं से निपटने, और अलगाव और संस्कृति शर्तों के अनुकूलन के लिए विकल्प की एक किस्म की पेशकश करते हैं.
Introduction
कृंतक हृदय कोशिकाओं की सफल हदबंदी और संस्कृति के लिए जल्द से जल्द रिपोर्ट वापस 1960 के 1,2 करने के लिए तारीखें. फिर भी, Harary और फ़ार्ले सुसंस्कृत cardiomyocytes "आवधिक सिकुड़ना की आवश्यकताओं के अध्ययन के लिए एक अनूठी प्रणाली प्रदान कर सकता है [, और हो सकता है] [पिटाई] प्रक्रिया के लिए विभिन्न चयापचय मार्ग के योगदान का निर्धारण करने का एक साधन प्रदान" देखा. युवा चूहों, और मूल प्रोटोकॉल से Harary और फ़ार्ले पृथक और सुसंस्कृत cardiomyocytes वर्षों में रूपांतरित किया और कई वैज्ञानिकों द्वारा संशोधित किया गया है, सामान्य अलगाव और संवर्धन प्रक्रिया बहुत नहीं बदली है. हालांकि, बेहतर एंजाइमों 3, मानकीकृत समाधान 4,5, और अलगाव की प्रक्रिया 6-9 दौरान कोशिकाओं की रक्षा के लिए प्रतिवर्ती चैनल और मायोसिन ATPase अवरोध करनेवाला BDM के अलावा काफी सेल उपज और व्यवहार्यता में सुधार हुआ है.
नवजात cardiomyo बनाम वयस्कcytes
नवजात चूहों या चूहों से अलग और सुसंस्कृत cardiomyocytes वयस्क cardiomyocytes की संस्कृतियों पर कई फायदे हैं. वयस्क माउस या चूहा 10 से cardiomyocytes के अलगाव की तुलना में जब अग्रणी, नवजात माउस या चूहा दिल के लिए अलगाव की प्रक्रिया, आसान और कम महंगा है. नवजात cardiomyocytes बहुत सेल उपज में वृद्धि, हदबंदी के बाद एक कैल्शियम युक्त मध्यम में reintroduction के लिए अब तक कम संवेदनशील होते हैं. वयस्क cardiomyocytes आमतौर पर संकुचन प्रेरित करने के लिए पेसिंग की आवश्यकता होती है, जबकि आम तौर पर अनायास चढ़ाना के बाद कोशिकाओं को 20 घंटे की धड़कन में यह परिणाम है कि redifferentiation चक्र – एक और बड़ा लाभ यह है कि नवजात माउस cardiomyocytes एक और अधिक तेजी dedifferentiation से गुजरना है. वयस्क cardiomyocytes ट्रांसजेनिक डीएनए के सफल प्रसव के लिए वायरल वैक्टर की आवश्यकता होती है, जबकि नवजात cardiomyocytes, अधिक आसानी से भी लिपोसोमल अभिकर्मक तरीकों के साथ transfectable हैं. नवजात cardiomyocyte के विपरीतएस, वयस्क कृंतक cardiomyocytes 11-13 की संस्कृति myofibrillar गिरावट और सिकुड़ा तंत्र के अंतिम reestablishment की जांच के लिए अनुमति देता है. वयस्क cardiomyocytes में इन विशेषता morphological परिवर्तन 1-2 सप्ताह की अवधि में पाए जाते हैं. dedifferentiation – redifferentiation चक्र जिससे मानव cardiomyopathies 14 में मनाया रोग परिवर्तन की नकल उतार, भ्रूण जीन कार्यक्रम के reexpression के साथ है. नवजात cardiomyocytes की संस्कृति से अधिक वयस्क चूहे cardiomyocytes की एक और लाभ यह समय की लंबी अवधि के लिए संस्कृति करने की क्षमता इन कोशिकाओं है.
माउस cardiomyocytes बनाम चूहा
चूहे नवजात cardiomyocytes के अलगाव और संस्कृति व्यवहार्य कोशिकाओं की उच्च पैदावार और बढ़ अभिकर्मक दरों सहित माउस नवजात cardiomyocytes, उस पर कुछ फायदे हैं. हालांकि, हृदय रोगों के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल का व्यापक उपयोग (जैसे </ उन्हें> फैली हुई cardiomyopathy 15 के लिए मॉडल के रूप में पेशी लिम प्रोटीन पीटकर माउस) नवजात चूहों से व्युत्पन्न cardiomyocytes के लिए अलगाव की प्रक्रिया का अनुकूलन करने के लिए प्रेरित किया है. नवजात चूहे और माउस cardiomyocytes अलग करने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल लगभग समान हैं, अधिक से अधिक देखभाल बाद के लिए एक उपयुक्त एंजाइम मिश्रण के चयन में लिया जाना चाहिए. दरअसल, नवजात माउस cardiomyocytes एक कम सेल उपज और व्यवहार्यता, जिसके परिणामस्वरूप आम तौर पर overdigestion लिए अतिसंवेदनशील होते हैं. नवजात चूहों से व्युत्पन्न cardiomyocytes नवजात चूहे दिल से ली गई कोशिकाओं की तुलना में कुछ हद तक छोटे होते हैं इसके अलावा, चढ़ाना घनत्व, समायोजित किया जाना चाहिए.
रूपात्मक, electrophysiological, जैव रासायनिक, सेल जैविक और biomechanical मापदंडों के साथ ही myofibrillogenesis की प्रक्रिया के लिए की जांच के लिए कई प्रयोग के साथ, सुसंस्कृत नवजात cardiomyocytes के अध्ययन के लिए सबसे बहुमुखी प्रणालियों में से एक बन गए हैंइन विट्रो में हृदय सेल काम करता है. एक सफल परख करने के लिए पहला कदम हालांकि, नवजात माउस cardiomyocytes अलग करने के लिए एक आसान और विश्वसनीय पद्धति पर निर्भर करता है. हमारे प्रोटोकॉल कई स्रोतों से अपनी कार्यप्रणाली ड्रॉ और reproducibility और मजबूती के लिए अनुकूलित किया गया था. हम cardiomyocyte उपज और व्यवहार्यता को प्रभावित करने वाले कारकों पर चर्चा, और अलगाव और संस्कृति शर्तों के अनुकूलन के लिए विकल्प की एक किस्म प्रदान करते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
हृदय रोगों का अध्ययन करने के लिए पशु मॉडल का उपयोग हृदय अनुसंधान में मानक बन गया है. इन मॉडलों में से करीब जैव रासायनिक लक्षण वर्णन (यानी जैव रासायनिक या biomechanical उत्तेजनाओं को हृदय कोशिकाओं की प्रत्यक?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम प्रो अवकाश प्राप्त ज्यां क्लाड Perriard और एवलिन Perriard नवजात चूहे और माउस cardiomyocytes के लिए अलगाव की तकनीक में परिचय के लिए (प्रौद्योगिकी, स्विट्जरलैंड के स्विस फेडरल इंस्टीट्यूट) के लिए आभारी हैं. हम उनके समर्थन के लिए प्रो जू चेन और प्रो सिल्विया इवांस (UCSD, यूएसए) धन्यवाद देना चाहूंगा. ई की प्रयोगशाला में काम एक एमआरसी कैरियर स्थापना अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था. एसएल एनआईएच / NHLBI (HL107744) से स्वतंत्रता पुरस्कार के लिए एक K99/R00 मार्ग द्वारा समर्थित है. TMM अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (11POST7310066) से एक postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
| Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
| 1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | e.g. cellgro | 25-053-CI | |
| 1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | e.g. cellgro | 30-002-Cl | |
| 1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
| HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | e.g. cellgro | 21-022-CV | |
| DMEM high glucose | e.g. cellgro | 10-013-CV | |
| M-199 | e.g. cellgro | 10-060-CV | |
| fetal bovine serum | e.g. cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
| horse serum | e.g. cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
| Leibovitz L-155 | e.g. cellgro | 10-045-CV | |
| AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
| phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| 0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
| 3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
| cell strainer | e.g. Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
| syringe filter 0.2 μm | e.g. Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
| straight scissors | e.g. Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
| curved scissors | e.g. Fine Science Tools | 91461-11 | |
| Dumont No. 7 forceps | e.g. Fine Science Tools | 91197-00 | |
| perforated spoon | e.g. Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
| Trypan blue | e.g. Gibco | 15250-061 | live cell staining |
| Neubauer hemocytometer | e.g. Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
| 50 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 14-432-23 | |
| 15 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 05-527-90 | |
| 20 ml syringe | e.g. BD Medical | 14-820-19 | |
| 10 ml serological pipette | e.g. Falcon | 357551 | |
| 30 mm cell culture dish | e.g. Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
| 30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
| 10 cm cell culture dish | e.g. Nunc | 172958 | for preplating |
| Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
|
Referências
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