新生仔マウス心筋細胞の単離および培養

Summary

初代マウス心筋細胞培養は、筋原線維組織や機能の調査のための極めて重要なツールの一つである。以下のプロトコルは、新生児マウスの心臓から初代心筋細胞の単離および培養について説明します。得られた心筋細胞培養物は、続いて、生体力学的、生化学的および細胞生物学の種々のアッセイに使用することができる。

Abstract

培養された新生児の心筋細胞は、長いmyofibrillogenesisと筋原線維の機能を研究するために使用されてきた。培養心筋簡単な調査と操作生化学的経路の、そして自然に心筋細胞を破っての生体力学的特性に及ぼす影響を考慮。

次の2日間のプロトコルは、新生児マウスの心筋細胞の単離および培養について説明します。我々は簡単に、新生児の心臓を解剖心臓組織を解離し、心臓の細胞集団から心筋細胞を豊かにする方法を示しています。我々は、細胞分離のために異なる酵素混合物の使用、および細胞生存性に与える影響を議論。孤立した心筋細胞は、その後、形態的、電気生理学的、生化学的、細胞生物学的または生体力学的検定のさまざまな目的で使用することができます。私たちは、商業的に利用可能なソリューションを使用することにより、堅牢性と再現性のためのプロトコルを最適化し、酵素がそのSHをミックスOW少しロット間変動。また、心筋細胞の単離および培養に関連する一般的な問題に対処し、単離および培養条件の最適化のためのさまざまなオプションを提供します。

Introduction

げっ歯類の心臓細胞の正常な解離と文化のための最も初期の報告は、1960年の^1,2にさかのぼります。それでも、ハラリィとファーリーは培養心筋細胞は「定期収縮の要件の研究のためのユニークなシステムを提供することができ、[、とあり] [鼓動]プロセスのための様々な代謝経路の寄与を決定する手段を提供する」ことに気づいた。幼若ラット、元のプロトコルからハラリィとファーリー単離し、培養心筋細胞は、長年にわたって適応し、多くの科学者によって変更されているが、一般的な単離·培養手順が大幅に変更されていません。しかし、より良い酵素^3、標準化されたソリューションを^4,5、および単離手順^6-9の間に細胞を保護する可逆チャンネルとミオシンATPアーゼ阻害剤BDMの添加は、細胞収量及び生存率を改善した。

新生児cardiomyo対アダルトcytes

新生児マウスまたはラットから単離し、培養心筋細胞は、成人の心筋細胞の培養液に比べていくつかの利点がある。成体マウスまたはラット¹⁰から心筋細胞の単離と比較した場合、まず、新生仔マウスまたはラットの心臓の分離手順は、簡単かつ低コストである。新生児心筋細胞が大幅に細胞収量を増加させる、解離後のカルシウム含有培地中に再導入するためにはるかに敏感である。大人の心筋細胞は、通常、収縮を誘発するためにペーシングが必要ですが、一般的に、めっき後自発的に拍動細胞では20時間後に、その結​​果、再分化サイクル – もう一つの大きな利点は、新生児マウスの心筋細胞は、より迅速な脱分化を受けることである。新生児の心筋細胞は、成人の心筋細胞は、トランスジェニックDNAの正常な配信のためのウイルスベクターを必要とするのに対して、より容易に、リポソームトランスフェクション法でトランスフェでもある。新生児心筋細胞とは対照的にS、成人の齧歯類心筋細胞^11〜13の文化は、筋原線維の劣化と収縮装置の最終的な再構築の検討が可能になります。成人の心筋細胞におけるこれらの特徴的な形態変化は、1〜2週間の期間にわたって発生する。脱分化-再分化サイクルは、それによって人間の心筋症¹⁴で観察された病理学的変化を模倣し、胎児の遺伝子プログラムの再発現を伴う。新生児の心筋細胞を培養上の大人のラットの心筋細胞のもう一つの利点は、長期間培養することができることは、これらの細胞である。

マウスの心筋細胞対ラット

ラット新生児心筋細胞の単離および培養は、生細胞のより高い収量の増加、トランスフェクション率を含むマウス新​​生児の心筋細胞のそれ以上のいくつかの利点があります。しかし、心疾患のため、遺伝子組み換えマウスモデルの幅広い使用方法（ 例えば、</ em>は拡張型心筋症¹⁵のモデルとして筋肉LIMタンパク質ノックアウトマウス）は、新生児マウス由来の心筋細胞の分離手順の適応につながっている。新生ラットとマウスの心筋細胞を分離するために使用されるプロトコルは、ほとんど同じですが、より大きな注意が、後者のための適切な酵素ミックスの選択に注意する必要があります。実際、新生児マウスの心筋細胞は、減少した細胞収量および生存度で、その結果、一般的には過剰消化を受けやすい。新生仔マウス由来の心筋細胞が新生児ラット心臓由来の細胞と比較してやや小さいのでさらに、播種密度は、調整されるべきである。

形態的、電気生理学的、生化学的、細胞生物学的および生体力学的パラメータだけでなく、myofibrillogenesisのプロセスのための調査のための多くの用途で、培養された新生児心筋細胞の研究のための最も汎用的なシステムの一つとなっているin vitroでの心臓細胞の機能。成功した検定への第一歩は、しかし、新生児マウスの心筋細胞を分離するための簡単​​で信頼性の高い方法論に依存します。我々のプロトコルは、多くのソースから、その方法論を引き出し、再現性と堅牢性のために最適化された。我々は心筋細胞の収率および生存率に影響を与える要因について議論し、単離および培養条件の最適化のためのさまざまなオプションを提供しています。

Protocol

次の手順では、新生児マウスの心筋細胞の単離および培養のための2日間のプロトコル16,17について説明します。すべてのソリューションは、無菌または滅菌濾過される。すべてのツールは、75％エタノールで表面殺菌により滅菌されています。初期の組織摘出を除き、全ての工程を無菌層流細胞培養フード内で行っている。このプロトコルは、ワンツーごみ（S）からの新生児…

Representative Results

このプロトコルを使用して、我々は（ 図1A、1B、補足映画S1）8一日古い新生仔マウスからの心臓を単離した。洗濯やハサミ（ 図1C-1F）と心をミンチした後、組織片を穏やかに撹拌しながら4℃で一晩分離培地で予め消化された。前消化（ 図1G）に続いて、我々は新たに作製した消化培地に組織片を移して、穏やかに攪拌しながら37℃で20分間の組織片を培養…

Discussion

心疾患を研究するための動物モデルを使用することは、心臓血管研究の標準となっている。クローサー（ すなわち 、生化学的または生体力学的刺激に心臓細胞の直接の反応を研究する）これらのモデルの生化学的特徴は、一般的に、心臓組織または心筋細胞の単離を必要とする。心の生理学的反応を調査した研究は、生体外 （ 例えば ^40をアセチルコリンに対す?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8	Sigma	B-0753	prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.
Collagenase/Dispase	Roche	10269638001	can be substituted with collagenase type II from Worthington
Collagenase type II3	Worthington	CLS-2	substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA	e.g. cellgro	25-053-CI
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS	e.g. cellgro	30-002-Cl
1x PBS (without Ca2+, Mg2+)	e,g, cellgro	21-040-CV
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4	e.g. cellgro	21-022-CV
DMEM high glucose	e.g. cellgro	10-013-CV
M-199	e.g. cellgro	10-060-CV
fetal bovine serum	e.g. cellgro	35-011-CV	cell-culture grade
horse serum	e.g. cellgro	35-030-CV	cell-culture grade
Leibovitz L-155	e.g. cellgro	10-045-CV
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)	Sigma	C-6645	proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C
phenylephrine	Sigma	P-6126	chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
isoproterenol hydrochloride	Sigma	I-6501	chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
0.1% collagen solution	Sigma	C-8919	extracellular matrix for coating
3 mg/ml collagen type 1 solution	Advanced BioMatrix	5005-B	alternative to Sigma collagen solution
cell strainer	e.g. Fisherbrand	22363548	appropriate filter size:40 μm-100 μm
syringe filter 0.2 μm	e.g. Fisherbrand	09-719C	for sterile filtration of digestion medium
straight scissors	e.g. Fine Sciences Tools	91460-11
curved scissors	e.g. Fine Science Tools	91461-11
Dumont No. 7 forceps	e.g. Fine Science Tools	91197-00
perforated spoon	e.g. Fine Science Tools	10370-19	optional, for transfer of heart tissue
Trypan blue	e.g. Gibco	15250-061	live cell staining
Neubauer hemocytometer	e.g. Prosource Scientific	3500	alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems
50 ml Falcon tubes	e.g. Fisherbrand	14-432-23
15 ml Falcon tubes	e.g. Fisherbrand	05-527-90
20 ml syringe	e.g. BD Medical	14-820-19
10 ml serological pipette	e.g. Falcon	357551
30 mm cell culture dish	e.g. Nunc	153066	for standard culture of cardiomyocytes
30 mm cell culture dish, glass bottom	MatTek	P35G-0-10-C	for live cell imaging with inverted microscope
10 cm cell culture dish	e.g. Nunc	172958	for preplating
Escort III	Sigma	L3037	for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000
Lipofectamine 2000	Life Technologies, Invitrogen	52887	substitute for Escort III
			Buffers and media: Isolation medium (filter sterilize) 20 mM BDM 0.0125% trypsin in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+) Digestion medium (filter sterilize) 20 mM BDM 1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix in L15 medium Plating medium 65% DMEM high glucose 19% M-199 10% horse serum 5% fetal calf serum 1% penicillin/streptomycin Maintenance medium 78% DMEM high glucose 17% M-199 4% horse serum 1% penicillin/streptomycin optional: 1 μM AraC 1 μM isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine The plating and maintenance medium can be stored at 4 °C for up to 6 months.