分离新生小鼠心肌文化和

Summary

原代小鼠心肌细胞培养物的肌原纤维组织和功能的研究的关键工具之一。以下协议描述了从新生小鼠心脏原发性心肌细胞的分离和培养。所得到的心肌细胞培养物随后可用于各种生物力学，生物化学和细胞生物学测定。

Abstract

培养的乳鼠心肌细胞长期被用来研究肌丝和肌原纤维的功能。培养的心肌细胞可以很容易调查的生化途径和操作，以及它们对自发跳动的心肌细胞的生物力学特性的影响。

下面2日协议描述的新生小鼠心肌细胞的分离和培养。我们将展示如何轻松地从新生儿心脏解剖，游离心脏组织，并从心脏细胞群丰富的心肌细胞。我们讨论了不同酶混合的用法细胞解离，及其对细胞活力的影响。分离的心肌细胞随后可以用于各种形态，电生理，生化，细胞生物或生物力学分析。我们优化了协议鲁棒性和再现性，通过仅使用市售溶液和酶混合了的shOW小批与批之间变化。我们还应对与心肌细胞的分离和培养相关的常见问题，并提供了多种用于分离和培养条件的优化选项。

Introduction

对啮齿动物的心脏细胞的成功分离并培养了最早报道可以追溯到1960年的^1,2。即使这样，Harary和法利注意到，培养的心肌细胞“可提供的周期性收缩的要求，研究一个独特的系统[，并可能]提供确定的[跳动]过程中的各种代谢途径的贡献的一种手段”。虽然Harary和法利从幼鼠，和原来的协议分离培养的心肌细胞已被改编，被许多科学家修改多年来，一般隔离和培养过程并没有很大的变化。然而，更好的酶^3，标准化解决方案^4,5和加法可逆信道和肌球蛋白ATP酶抑制剂BDM分离过程^6-9期间保护细胞的有显著改善细胞产量和活力。

成人与新生大鼠心肌核细胞

心肌细胞的分离，培养新生小鼠或大鼠有超过成人的心肌细胞培养几个优点。最重要的，在分离过程中对新生小鼠或大鼠心脏更容易且成本更低，相对于从成年小鼠或大鼠心肌细胞¹⁰的隔离。新生心肌远远不敏感，再引入含钙介质离解后，极大地提高细胞产量。另一大优势是，新生小鼠心肌细胞进行更快速的分化 – 再分化周期，通常会产生电镀后自发跳动的细胞20小时，而成人的心肌细胞通常需要起搏诱导收缩。乳鼠心肌细胞也更容易转染的脂质体转染方法，而成人的心肌细胞需要病毒载体成功传递转基因DNA的。相反，新​​生心肌细胞秒，成年啮齿动物心肌^11-13文化允许的肌原纤维的降解和收缩设备的最终重建的调查。在成人的心肌细胞，这些特征的形态学变化发生在1-2周时间。去分化-再分化周期是伴随胎儿基因程序的再表达，从而模拟在人心肌病¹⁴观察到的病理变化。成年大鼠心肌细胞在新生大鼠心肌文化的另一个优点是能够培养这些细胞很长一段时间。

大鼠与小鼠的心肌细胞

新生大鼠心肌细胞的分离和培养有一定的好处超过了小鼠乳鼠心肌细胞，包括活细胞的产量更高，增加了转染率。然而，转基因小鼠模型心脏疾病的广泛使用（ 如</ em>的肌肉LIM蛋白基因敲除小鼠为模型，扩张型心肌病^15），导致了分离过程的适应从新生小鼠的心肌。虽然用于分离新生大鼠和小鼠心肌的协议几乎是相同的，更大的关怀必须采取适当的酶混合物，后者的选择。事实上，新生小鼠心肌细胞一般都比较容易过量，造成降低的细胞产量和活力。此外，铺板密度应调整，因为相比于从新生大鼠心脏的细胞从新生小鼠衍生的心肌细胞是要小一些。

与许多用途的形态，电生理，生物化学，细胞生物学和生物力学参数以及为肌丝的过程进行调查，培养的乳鼠心肌细胞已成为最通用的系统的研究之一心肌细胞功能的体外 。第一步，一个成功的实验然而，依赖于一个简单而可靠的方法来隔离乳鼠心肌细胞。我们的协议借鉴其方法有很多，是为再现性和鲁棒性优化。我们讨论了影响心肌的产量和活力的因素，以及对分离和培养条件的优化提供了多种选择。

Protocol

下面的过程描述了为期两天的协议16,17对新生小鼠心肌细胞的分离和培养。所有溶液是无菌的或无菌过滤。所有的工具都通过表面杀菌消毒用75％的乙醇。除了最初的组织提取，所有步骤都在无菌层流细胞培养罩进行。此协议的目的是为新生小鼠心脏从一个个垃圾（次）的隔离 – 约5-14幼崽，但可以适用于较大的窝产仔数和新生大鼠心肌细胞。规模媒体/酶用量（如适用）。 <p class="jove_con…

Representative Results

使用此协议，我们分离的心从8一日龄新生小鼠（ 图1A，1B，追加电影S1）。洗涤和切碎的心，用剪刀（ 图1C-1F）后，组织碎片在预消化分离培养基过夜，4℃，轻轻摇动。以下简化（ 图1G），我们将其组织碎片进入新鲜的消化培养基，并温育的组织碎片20分钟，在37℃下缓慢搅拌。将所得细胞悬浮液（ 图1H），是通过细胞过滤网（ 图1G）</strong…

Discussion

利用动物模型来研究心脏疾病在心血管研究已经成为标准。这些模型的建立更紧密的生化特性（ 即研究心肌细胞的直接反应，生物化学或生物力学刺激）通常需要心脏组织或心肌细胞的分离。调查研究心脏的生理反应体外 （ 如对乙酰胆碱^40，或在缺血再灌注场景^41）一般采用的Langendorff灌注整个心灵^42,43，而植体培养心肌组织碎片^44,45允许对心?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8	Sigma	B-0753	prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.
Collagenase/Dispase	Roche	10269638001	can be substituted with collagenase type II from Worthington
Collagenase type II3	Worthington	CLS-2	substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA	e.g. cellgro	25-053-CI
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS	e.g. cellgro	30-002-Cl
1x PBS (without Ca2+, Mg2+)	e,g, cellgro	21-040-CV
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4	e.g. cellgro	21-022-CV
DMEM high glucose	e.g. cellgro	10-013-CV
M-199	e.g. cellgro	10-060-CV
fetal bovine serum	e.g. cellgro	35-011-CV	cell-culture grade
horse serum	e.g. cellgro	35-030-CV	cell-culture grade
Leibovitz L-155	e.g. cellgro	10-045-CV
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)	Sigma	C-6645	proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C
phenylephrine	Sigma	P-6126	chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
isoproterenol hydrochloride	Sigma	I-6501	chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
0.1% collagen solution	Sigma	C-8919	extracellular matrix for coating
3 mg/ml collagen type 1 solution	Advanced BioMatrix	5005-B	alternative to Sigma collagen solution
cell strainer	e.g. Fisherbrand	22363548	appropriate filter size:40 μm-100 μm
syringe filter 0.2 μm	e.g. Fisherbrand	09-719C	for sterile filtration of digestion medium
straight scissors	e.g. Fine Sciences Tools	91460-11
curved scissors	e.g. Fine Science Tools	91461-11
Dumont No. 7 forceps	e.g. Fine Science Tools	91197-00
perforated spoon	e.g. Fine Science Tools	10370-19	optional, for transfer of heart tissue
Trypan blue	e.g. Gibco	15250-061	live cell staining
Neubauer hemocytometer	e.g. Prosource Scientific	3500	alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems
50 ml Falcon tubes	e.g. Fisherbrand	14-432-23
15 ml Falcon tubes	e.g. Fisherbrand	05-527-90
20 ml syringe	e.g. BD Medical	14-820-19
10 ml serological pipette	e.g. Falcon	357551
30 mm cell culture dish	e.g. Nunc	153066	for standard culture of cardiomyocytes
30 mm cell culture dish, glass bottom	MatTek	P35G-0-10-C	for live cell imaging with inverted microscope
10 cm cell culture dish	e.g. Nunc	172958	for preplating
Escort III	Sigma	L3037	for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000
Lipofectamine 2000	Life Technologies, Invitrogen	52887	substitute for Escort III
			Buffers and media: Isolation medium (filter sterilize) 20 mM BDM 0.0125% trypsin in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+) Digestion medium (filter sterilize) 20 mM BDM 1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix in L15 medium Plating medium 65% DMEM high glucose 19% M-199 10% horse serum 5% fetal calf serum 1% penicillin/streptomycin Maintenance medium 78% DMEM high glucose 17% M-199 4% horse serum 1% penicillin/streptomycin optional: 1 μM AraC 1 μM isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine The plating and maintenance medium can be stored at 4 °C for up to 6 months.