Isolement et culture de cardiomyocytes de souris néonatales

Summary

Cultures de cardiomyocytes de souris primaires sont un des outils les pivots de l'enquête de l'organisation et de la fonction myofibrillaire. Le protocole suivant décrit l'isolement et la culture des cardiomyocytes primaires de coeurs de souris néonatales. Les cultures de cardiomyocytes résultants peuvent être ensuite utilisés pour une variété de tests biomécaniques, biochimiques et cellulaires biologiques.

Abstract

Cardiomyocytes néonataux en culture ont longtemps été utilisés pour étudier myofibrillogenesis et fonctions myofibrillaires. Cardiomyocytes cultivés permettent d'enquête facile et la manipulation des voies biochimiques, et leur effet sur les propriétés biomécaniques de battre cardiomyocytes spontanément.

Le protocole 2 jours suivant décrit l'isolement et la culture de cardiomyocytes de souris néonatales. Nous montrons comment disséquer facilement cœur de nouveau-nés, dissocier le tissu cardiaque et d'enrichir les cardiomyocytes de la cellule-population cardiaque. Nous discutons de l'utilisation de différents mélanges d'enzymes pour dissociation des cellules, et leurs effets sur les cellules-viabilité. Les cardiomyocytes isolés peuvent ensuite être utilisés pour une variété d'analyses morphologiques, biochimiques, électrophysiologiques de cellules biologiques ou biomécanique. Nous avons optimisé le protocole pour la robustesse et la reproductibilité, en utilisant des solutions seulement disponibles dans le commerce et l'enzyme mélanges que show peu de variabilité de lot à lot. Nous abordons également les problèmes courants liés à l'isolement et la culture des cardiomyocytes, et offrons une variété d'options pour l'optimisation des conditions d'isolement et de culture.

Introduction

Les premiers rapports de la dissociation de succès et de la culture de cellules cardiaques de rongeurs remonte au 1960 ^1,2. Même alors, Harary et Farley ont remarqué que des cardiomyocytes cultivés "peuvent fournir un système unique pour l'étude des exigences de la contractilité périodique [, et peuvent] fournir un moyen de déterminer la contribution des différentes voies métaboliques pour la [battre] processus». Bien Harary et Farley cardiomyocytes isolés et cultivés de jeunes rats, et le protocole original a été adapté et modifié par de nombreux scientifiques au cours des années, l'isolement et la culture procédure générale n'a pas beaucoup changé. Cependant, l'amélioration des enzymes, des solutions standardisées ^{3 4,5,} et l'addition de la chaîne et un inhibiteur réversible de la myosine ATPase BDM à protéger les cellules au cours de la procédure d'isolement ^6-9 a considérablement amélioré le rendement de cellules et la viabilité.

Adulte vs cardiomyo néonatalecytes

Cardiomyocytes isolés et cultivés à partir de souris ou de rats nouveau-nés ont plusieurs avantages par rapport à des cultures de cardiomyocytes adultes. Tout d'abord, la procédure d'isolement de rat ou de souris néonatales coeurs est plus facile et moins coûteux, par rapport à l'isolement des cardiomyocytes à partir de souris ou de rat adulte ^10. Cardiomyocytes néonataux sont beaucoup moins sensibles à la réintroduction dans un milieu contenant du calcium après dissociation, augmentant considérablement cellule rendement. Un autre grand avantage est que les cardiomyocytes de souris néonatales subissent une dédifférenciation plus rapide – cycle de redifférenciation qui se traduit généralement par battant spontanément cellules 20 heures après l'étalement, tout en cardiomyocytes adultes ont généralement besoin de stimulation pour induire la contraction. Cardiomyocytes néonataux sont également plus facilement transfectable avec des méthodes de transfection liposomale, alors que les cardiomyocytes adultes exigent des vecteurs viraux pour la livraison réussie de l'ADN transgénique. Contrairement aux cardiomyocytes néonatauxs, la culture de cardiomyocytes de rongeurs adultes ^{de 11 à 13} permet à des investigations de la dégradation myofibrillaire et rétablissement éventuel de l'appareil contractile. Ces changements morphologiques caractéristiques de cardiomyocytes adultes se produisent sur des périodes de 1-2 semaines. La dédifférenciation – cycle de re-différenciation s'accompagne de réexpression du programme de gène foetal, mimant ainsi les changements pathologiques observées dans les cardiomyopathies humaines ^14. Un autre avantage de cardiomyocytes de rats adultes de plus la culture de cardiomyocytes néonataux est la capacité de la culture de ces cellules pendant de longues périodes de temps.

Rat vs cardiomyocytes de souris

L'isolement et la culture des cardiomyocytes néonataux de rat a quelques avantages par rapport à celle des cardiomyocytes néonataux de souris, y compris des rendements plus élevés de cellules viables et une augmentation des taux de transfection. Cependant, la large utilisation de modèles de souris génétiquement modifiées pour les maladies cardiaques (par exemple </ Em> la lim de protéines musculaires souris knock-out comme modèle pour la cardiomyopathie dilatée ¹⁵⁾ a conduit à l'adaptation de la procédure d'isolement pour les cardiomyocytes dérivés de souris néonatales. Bien que les protocoles utilisés pour isoler des cardiomyocytes de rat et de souris néonatales sont presque identiques, plus il faut prendre soin dans le choix d'un mélange d'enzyme approprié pour celui-ci. En effet, les cardiomyocytes de souris néonatales sont généralement plus sensibles à une digestion excessive, résultant dans une cellule-rendement et la viabilité réduite. En outre, la densité de placage doit être ajusté, cardiomyocytes, car dérivées de souris néonatale sont un peu plus petite par rapport à des cellules dérivées de coeurs de rats nouveau-nés.

Avec beaucoup d'utilisations pour l'enquête de paramètres morphologiques, électrophysiologiques, biochimiques, cellulaires biologiques et biomécaniques ainsi que pour le processus de myofibrillogenesis, cardiomyocytes néonataux de culture sont devenus l'un des systèmes les plus polyvalents pour l'étude deles fonctions des cellules cardiaques in vitro. Toutefois, la première étape d'un essai réussi dépend d'une méthodologie simple et fiable pour isoler les cardiomyocytes de souris néonatales. Notre protocole tire sa méthodologie de nombreuses sources et a été optimisée pour la reproductibilité et la robustesse. Nous discutons des facteurs qui influent sur cardiomyocytes rendement et la viabilité, et offrons une variété d'options pour l'optimisation des conditions d'isolement et de culture.

Protocol

La procédure qui suit décrit un protocole de 16,17 à deux jours pour l'isolement et la culture des cardiomyocytes de souris néonatales. Toutes les solutions sont stériles ou stérilisées par filtration. Tous les outils sont stérilisés par stérilisation de surface avec 75% d'éthanol. À l'exception de l'extraction initiale du tissu, toutes les étapes sont réalisées dans une cellule à flux laminaire culture hotte stérile. Ce protocole est destiné à l'isolation des coeurs de …

Representative Results

En utilisant ce protocole, nous avons isolé les cœurs de 8 âge d'un jour souriceaux nouveau-nés (figures 1A, 1B, film supplémentaire S1). Après lavage et hacher les coeurs avec des ciseaux (figures 1C-1F), des fragments de tissus ont été prédigérés en milieu d'isolement pendant une nuit à 4 ° C sous agitation douce. À la suite de prédigestion (Figure 1G), on a transféré les fragments de tissus fraîchement préparé en milieu de digestion, et on…

Discussion

L'utilisation de modèles animaux pour étudier les maladies cardiaques est devenu un standard dans la recherche cardiovasculaire. La caractérisation biochimique rapprocher de ces modèles (c.-à étudier les réponses directes des cellules cardiaques à des stimuli biochimiques ou biomécaniques) nécessite généralement l'isolement des tissus cardiaques ou cardiomyocytes. Les études portant sur ​​les réactions physiologiques du cœur ex vivo (par exemple à l'acétylcholine ^4…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8	Sigma	B-0753	prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.
Collagenase/Dispase	Roche	10269638001	can be substituted with collagenase type II from Worthington
Collagenase type II3	Worthington	CLS-2	substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA	e.g. cellgro	25-053-CI
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS	e.g. cellgro	30-002-Cl
1x PBS (without Ca2+, Mg2+)	e,g, cellgro	21-040-CV
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4	e.g. cellgro	21-022-CV
DMEM high glucose	e.g. cellgro	10-013-CV
M-199	e.g. cellgro	10-060-CV
fetal bovine serum	e.g. cellgro	35-011-CV	cell-culture grade
horse serum	e.g. cellgro	35-030-CV	cell-culture grade
Leibovitz L-155	e.g. cellgro	10-045-CV
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)	Sigma	C-6645	proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C
phenylephrine	Sigma	P-6126	chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
isoproterenol hydrochloride	Sigma	I-6501	chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
0.1% collagen solution	Sigma	C-8919	extracellular matrix for coating
3 mg/ml collagen type 1 solution	Advanced BioMatrix	5005-B	alternative to Sigma collagen solution
cell strainer	e.g. Fisherbrand	22363548	appropriate filter size:40 μm-100 μm
syringe filter 0.2 μm	e.g. Fisherbrand	09-719C	for sterile filtration of digestion medium
straight scissors	e.g. Fine Sciences Tools	91460-11
curved scissors	e.g. Fine Science Tools	91461-11
Dumont No. 7 forceps	e.g. Fine Science Tools	91197-00
perforated spoon	e.g. Fine Science Tools	10370-19	optional, for transfer of heart tissue
Trypan blue	e.g. Gibco	15250-061	live cell staining
Neubauer hemocytometer	e.g. Prosource Scientific	3500	alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems
50 ml Falcon tubes	e.g. Fisherbrand	14-432-23
15 ml Falcon tubes	e.g. Fisherbrand	05-527-90
20 ml syringe	e.g. BD Medical	14-820-19
10 ml serological pipette	e.g. Falcon	357551
30 mm cell culture dish	e.g. Nunc	153066	for standard culture of cardiomyocytes
30 mm cell culture dish, glass bottom	MatTek	P35G-0-10-C	for live cell imaging with inverted microscope
10 cm cell culture dish	e.g. Nunc	172958	for preplating
Escort III	Sigma	L3037	for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000
Lipofectamine 2000	Life Technologies, Invitrogen	52887	substitute for Escort III
			Buffers and media: Isolation medium (filter sterilize) 20 mM BDM 0.0125% trypsin in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+) Digestion medium (filter sterilize) 20 mM BDM 1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix in L15 medium Plating medium 65% DMEM high glucose 19% M-199 10% horse serum 5% fetal calf serum 1% penicillin/streptomycin Maintenance medium 78% DMEM high glucose 17% M-199 4% horse serum 1% penicillin/streptomycin optional: 1 μM AraC 1 μM isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine The plating and maintenance medium can be stored at 4 °C for up to 6 months.