Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten

Summary

Primäre Maus-Kardiomyozyten-Kulturen sind eines der zentralen Werkzeuge für die Untersuchung von myofibrillären Organisation und Funktion. Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von primären Kardiomyozyten aus neonatalen Mäuseherzen. Die resultierenden Kulturen Kardiomyozyten können anschließend für eine Vielzahl von biomechanischen, biochemischen und zellbiologischen Assays verwendet werden.

Abstract

Kultivierten neonatalen Kardiomyozyten seit langem verwendet, um Myofibrillogenese und myofibrillären Funktionen zu studieren. Kultivierte Kardiomyozyten ermöglichen eine einfache Untersuchung und Manipulation von biochemischen Wege, und ihre Wirkung auf die biomechanischen Eigenschaften des spontan schlagenden Herzmuskelzellen.

Die folgende 2-Tages-Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultivierung von neonatalen Kardiomyozyten der Maus. Wir zeigen, wie leicht zu sezieren Herzen von Neugeborenen, distanzieren das Herzgewebe und bereichern Kardiomyozyten aus dem Herz-Zell-Population. Wir diskutieren den Einsatz von verschiedenen Enzymmischungen für Zell-Dissoziation und ihre Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit. Die isolierten Herzmuskelzellen kann anschließend für eine Vielzahl von morphologischen, elektrophysiologischen, biochemischen und zellbiologischen biomechanische Tests verwendet werden. Wir optimieren das Protokoll für die Robustheit und Reproduzierbarkeit, indem nur kommerziell erhältlichen Lösungen und Enzymmischungen, dass show wenig viel-zu-viel Variabilität. Wir wenden uns auch gemeinsame Probleme mit der Isolierung und Kultivierung von Herzmuskelzellen verbunden und bieten eine Vielzahl von Optionen für die Optimierung der Isolation und der Kulturbedingungen.

Introduction

Die frühesten Berichte für die erfolgreiche Dissoziation und Kultur von Nagetier Herzzellen stammt aus dem 1960 ^1,2. Selbst dann Harary und Farley bemerkt, dass kultivierte Kardiomyozyten "kann eine einzigartige System für die Untersuchung von den Anforderungen des Perioden Kontraktilität [und kann] ein Mittel zur Bestimmung des Beitrages der verschiedenen Stoffwechselwege für die [Schlagen] Prozess". Obwohl Harary und Farley isolierten und kultivierten Kardiomyozyten aus jungen Ratten, und der ursprüngliche Protokoll wurde angepasst, und über die Jahre von vielen Wissenschaftlern geändert, hat die allgemeine Isolation und Kultivierung Verfahren nicht wesentlich verändert. Allerdings hat bessere Enzyme ^3, standardisierte Lösungen ^4,5, und die Zugabe des reversiblen Kanal-und Myosin-ATPase-Inhibitor BDM Zellen während der Isolationsverfahren ^9.6 Schutz deutlich verbessert Zell-Ertrag und Rentabilität.

Erwachsene vs Neugeborenen-Kardiomyozytenzyten

Kardiomyozyten isolierten und kultivierten neonatalen Mäusen oder Ratten haben mehrere Vorteile gegenüber Kulturen von adulten Kardiomyozyten. Vor allem ist das Isolierungsverfahren für neonatale Maus oder Rattenherzen einfacher und kostengünstiger im Vergleich zu der Isolierung von Kardiomyozyten aus adulten Maus oder Ratte ^10. Neonatale Kardiomyozyten sind weit weniger empfindlich auf in eine Calcium-haltigem Medium nach der Dissoziation Wiedereinführung, Zellausbeute stark erhöht. Ein weiterer großer Vorteil ist, dass neonatale Kardiomyozyten der Maus durchlaufen eine schnellere Entdifferenzierung – Redifferenzierung Zyklus, führt in der Regel spontan nach der Plattierung schlagen Zellen 20 Stunden, während adulte Kardiomyozyten erfordern in der Regel Tempo der Kontraktion induzieren. Neonatale Kardiomyozyten sind auch leichter transfizierbar mit liposomalen Transfektion Methoden, während adulte Kardiomyozyten erfordern virale Vektoren für die erfolgreiche Umsetzung der transgenen DNA. Im Gegensatz zur neonatalen Kardiomyozytens, die Kultur der erwachsenen Nagetieren Kardiomyozyten ^11-13 ermöglicht Untersuchungen von myofibrillären Abbau und späteren Wiederherstellung der kontraktilen Apparates. Diese charakteristischen morphologischen Veränderungen in adulten Kardiomyozyten treten über einen Zeitraum von ca. 1-2 Wochen. Die Entdifferenzierung – Redifferenzierung Zyklus wird durch Reexpression des fetalen Gen Programm begleitet, was in der menschlichen Kardiomyopathien ¹⁴ beobachteten pathologischen Veränderungen imitiert. Ein weiterer Vorteil des adulten Rattenherzmuskelzellen auf die Kultur von neonatalen Kardiomyozyten ist die Fähigkeit, diese Zellen Kultur für lange Zeiträume.

Ratten-Herzmuskelzellen gegen Maus

Die Isolierung und Kultivierung von neonatalen Ratten-Herzmuskelzellen hat einige Vorteile gegenüber der von der Maus neonatalen Kardiomyozyten, darunter höhere Ausbeuten an lebenden Zellen und erhöhte Transfektionsraten. Doch die breite Verwendung von genetisch veränderten Mausmodellen für Herzerkrankungen (zB </ Em> der Muskel lim Protein-Knockout-Maus als Modell für die dilatative Kardiomyopathie ¹⁵⁾ wurde auf die Anpassung der Verfahren für die Isolation von Kardiomyozyten neugeborenen Mäusen abgeleitet geführt. Obwohl die zur neonatalen Ratte und Maus Kardiomyozyten isolieren Protokolle sind nahezu identisch, müssen größere Sorgfalt bei der Auswahl eines geeigneten Enzymmischung für die letztere eingenommen werden. Tatsächlich sind neonatalen Maus Kardiomyozyten im allgemeinen anfälliger für overdigestion, was zu einer verringerten Zell Ausbeute und Lebensfähigkeit. Außerdem sollte die Beschichtung Dichte eingestellt werden, weil Kardiomyozyten aus neugeborenen Mäusen abgeleitet Vergleich zu Zellen von neugeborenen Rattenherzen abgeleitet sind etwas kleiner.

Bei vielen Anwendungen für die Untersuchung der morphologischen, elektrochemische, biochemische, zellbiologische und biomechanische Parameter als auch für das Verfahren der Myofibrillogenese haben kultivierten neonatalen Herzmuskelzellen zu einem der vielseitigsten Systeme für das Studium derHerzzellfunktionen in vitro. Der erste Schritt zu einem erfolgreichen Test hängt jedoch auf eine einfache und zuverlässige Methode zur neonatalen Kardiomyozyten der Maus zu isolieren. Unser Protokoll bezieht seine Methodik aus vielen Quellen und wurde für die Reproduzierbarkeit und Robustheit optimiert. Wir diskutieren Faktoren, die Kardiomyozyten-Ertrag und Rentabilität zu beeinflussen, und bieten eine Vielzahl von Optionen für die Optimierung der Isolation und der Kulturbedingungen.

Protocol

Das folgende Verfahren beschreibt eine zweitägige Protokoll 16,17 für die Isolierung und Kultivierung von neonatalen Kardiomyozyten der Maus. Alle Lösungen sind steril und steril filtriert. Alle Werkzeuge werden durch Oberflächensterilisation mit 75% Ethanol sterilisiert. Mit Ausnahme der anfänglichen Gewebeentnahme, werden alle Schritte in einer sterilen laminaren Strömung Zellkulturhaube durchgeführt. Dieses Protokoll wird für die Isolierung von neonatalen Mäuseherzen 1-2 Wurf (s) bestimmt – etwa 5…

Representative Results

Über dieses Protokoll isolierten wir Herzen aus 8 einen Tag alt neugeborenen Mäusen (1A, 1B, STADT Film S1). Nach dem Waschen und Zerkleinern der die Herzen mit einer Schere (1C-1F), Gewebefragmente wurden in Isolationsmedium über Nacht bei 4 ° C unter leichtem Schütteln vorverdaut. Nach Vorverdauung (1G), die Gewebefragmente übertragen wir in frisch gemacht Verdauung Medium und die Gewebefragmente für 20 min bei 37 ° C unter leichtem Schütteln. Die resultieren…

Discussion

Die Verwendung von Tiermodellen, um Herzerkrankungen zu untersuchen hat sich in der kardiovaskulären Forschung Standard. Closer biochemische Charakterisierung dieser Modelle (dh Studium direkte Antworten von Herzzellen zu biochemischen oder biomechanischen Reize) erfordert in der Regel die Isolierung von Herzgewebe oder Herzmuskelzellen. Studien, die physiologischen Reaktionen des Herzens ex vivo (z. B. Acetylcholin ⁴⁰ oder in Ischämie-Reperfusion Szenarien ⁴¹⁾ in der Regel nutz…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8	Sigma	B-0753	prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.
Collagenase/Dispase	Roche	10269638001	can be substituted with collagenase type II from Worthington
Collagenase type II3	Worthington	CLS-2	substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA	e.g. cellgro	25-053-CI
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS	e.g. cellgro	30-002-Cl
1x PBS (without Ca2+, Mg2+)	e,g, cellgro	21-040-CV
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4	e.g. cellgro	21-022-CV
DMEM high glucose	e.g. cellgro	10-013-CV
M-199	e.g. cellgro	10-060-CV
fetal bovine serum	e.g. cellgro	35-011-CV	cell-culture grade
horse serum	e.g. cellgro	35-030-CV	cell-culture grade
Leibovitz L-155	e.g. cellgro	10-045-CV
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)	Sigma	C-6645	proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C
phenylephrine	Sigma	P-6126	chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
isoproterenol hydrochloride	Sigma	I-6501	chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
0.1% collagen solution	Sigma	C-8919	extracellular matrix for coating
3 mg/ml collagen type 1 solution	Advanced BioMatrix	5005-B	alternative to Sigma collagen solution
cell strainer	e.g. Fisherbrand	22363548	appropriate filter size:40 μm-100 μm
syringe filter 0.2 μm	e.g. Fisherbrand	09-719C	for sterile filtration of digestion medium
straight scissors	e.g. Fine Sciences Tools	91460-11
curved scissors	e.g. Fine Science Tools	91461-11
Dumont No. 7 forceps	e.g. Fine Science Tools	91197-00
perforated spoon	e.g. Fine Science Tools	10370-19	optional, for transfer of heart tissue
Trypan blue	e.g. Gibco	15250-061	live cell staining
Neubauer hemocytometer	e.g. Prosource Scientific	3500	alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems
50 ml Falcon tubes	e.g. Fisherbrand	14-432-23
15 ml Falcon tubes	e.g. Fisherbrand	05-527-90
20 ml syringe	e.g. BD Medical	14-820-19
10 ml serological pipette	e.g. Falcon	357551
30 mm cell culture dish	e.g. Nunc	153066	for standard culture of cardiomyocytes
30 mm cell culture dish, glass bottom	MatTek	P35G-0-10-C	for live cell imaging with inverted microscope
10 cm cell culture dish	e.g. Nunc	172958	for preplating
Escort III	Sigma	L3037	for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000
Lipofectamine 2000	Life Technologies, Invitrogen	52887	substitute for Escort III
			Buffers and media: Isolation medium (filter sterilize) 20 mM BDM 0.0125% trypsin in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+) Digestion medium (filter sterilize) 20 mM BDM 1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix in L15 medium Plating medium 65% DMEM high glucose 19% M-199 10% horse serum 5% fetal calf serum 1% penicillin/streptomycin Maintenance medium 78% DMEM high glucose 17% M-199 4% horse serum 1% penicillin/streptomycin optional: 1 μM AraC 1 μM isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine The plating and maintenance medium can be stored at 4 °C for up to 6 months.