בידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד

Summary

תרבויות cardiomyocyte העכבר ראשיים הן אחד הכלים המרכזיים לחקירה של ארגון ותפקוד myofibrillar. הפרוטוקול הבא מתאר את הבידוד והתרבות של שריר לב עיקרי מלב עכבר בילוד. תרבויות cardiomyocyte וכתוצאה מכך עשויות לשמש בהמשך עבור מגוון רחב של מבחני ביומכנית, ביוכימי ותא ביולוגי.

Abstract

שריר לב בילוד תרבותי כבר מזמן משמש ללמוד myofibrillogenesis ופונקציות myofibrillar. שריר לב בתרבית מאפשר חקירה קלה ומניפולציה של מסלולים ביוכימיים, וההשפעה שלהם על המאפיינים ביומכניים של ספונטני להכות שריר לב.

פרוטוקול 2 הימים הבאים מתאר את הבידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד. אנו מראים כיצד לנתח בקלות את לב מילודים, לנתק את רקמת הלב ולהעשיר את שריר לב מתאי אוכלוסיית לב. אנחנו דנים בשימוש בתערובות אנזים שונות לתא דיסוציאציה, וההשפעות שלהם על תא את יכולת הקיום. שריר הלב המבודד יכול לשמש בהמשך עבור מגוון רחב של מבחני מורפולוגיים, אלקטרו, ביוכימיות, תא ביולוגי או ביומכנית. אנו מותאמים הפרוטוקול לחוסן ושחזור, על ידי שימוש בפתרונות רק זמינים מסחרית ואנזים מתערבב שshהשתנות קטנות ow הרבה להרבה. אנחנו גם להתמודד עם בעיות נפוצות הקשורות לבידוד והתרבות של שריר לב, ומציעים מגוון רחב של אפשרויות לאופטימיזציה של תנאי בידוד והתרבות.

Introduction

הדיווחים המוקדמים ביותר לניתוק והתרבות המוצלחים של תאי לב מכרסמים שתחילתה ב1960 של ^1,2. גם אז, הררי ופארלי שמו לב ששריר לב בתרבית "עשוי לספק מערכת ייחודית ללימוד הדרישות של ההתכווצות התקופתית [ואולי] לספק אמצעי קביעת התרומה של מסלולי מטבוליים שונים ל[ מכות] התהליך". למרות ששריר לב מבודד ומתורבת הררי ופארלי מחולדות צעירות, והפרוטוקול המקורי הותאם והותאם על ידי מדענים רבים במשך השנים, הליך הבידוד וculturing הכללי לא השתנה באופן משמעותי. עם זאת, אנזימים טובים יותר ^3, פתרונות סטנדרטיים ^4,5, והתוספת של הערוץ הפיך וBDM מעכבי ATPase שרירן כדי להגן על תאים במהלך הליך בידוד ^6-9 השתפרו באופן משמעותי תא תשואה וכדאיות.

מבוגרים לעומת cardiomyo בילודcytes

יש לי cardiomyocytes המבודד ומתורבת מעכברים או חולדות בילוד מספר יתרונות על פני תרבויות של שריר לב מבוגר. בראש ובראשונה, הליך הבידוד ללבם עכבר או עכברוש בילוד הוא קל יותר ויקר פחות, בהשוואה לבידוד של שריר לב מעכבר בוגר או חולדה ^10. cardiomyocytes ילודים הם הרבה פחות רגיש להשבה לטבע לבינוני מכיל סידן לאחר ניתוק, מאוד להגדיל תא תשואה. יתרון גדול נוסף הוא ששריר לב עכבר בילוד עובר טשטוש הבדלים מהיר יותר – מחזור redifferentiation שבדרך כלל תוצאות באופן ספונטני להכות תאים 20 שעות לאחר ציפוי, בעוד שבדרך כלל שריר לב מבוגר דורש לצעוד כדי לגרום להתכווצות. cardiomyocytes ילודים הם גם יותר בקלות transfectable עם שיטות transfection liposomal, ואילו שריר לב מבוגר דורש וקטורים ויראליים למסירה מוצלחת של ה-DNA המהונדס. בניגוד לcardiomyocyte בילודים, התרבות של cardiomyocytes מכרסמים המבוגר ^11-13 מאפשרת לחקירות של השפלה myofibrillar והקמתה מחדש סופו של דבר את מנגנון ההתכווצות. שינויים מורפולוגיים האופייניים אלה בשריר לב בוגרים מתרחשים על פני תקופות של 1-2 שבועות. טשטוש ההבדלים – מחזור redifferentiation מלווה reexpression של התכנית הגנטית של העובר, ובכך מחקה שינויים פתולוגיים שנצפו בcardiomyopathies אדם ^14. יתרון נוסף של שריר לב חולדה בוגר מעל התרבות של שריר לב בילוד הוא יכולת תרבות תאים אלה לפרקי זמן ארוכים.

עכברוש לעומת cardiomyocytes עכבר

יש הבידוד והתרבות של שריר לב בילוד חולדה כמה יתרונות על פני זו של שריר לב בילוד עכבר, כוללים תשואות גבוהות יותר של תאי קיימא ושיעורי transfection מוגברים. עם זאת, השימוש הרחב של מודלים עכבר מהונדסים גנטי למחלות לב (כגון: </ Em> העכבר בנוקאאוט חלבון Lim השרירים כמודל לcardiomyopathy מורחב ¹⁵⁾ הוביל לעיבוד של הליך הבידוד לשריר לב שנלקח מעכברים בילוד. למרות שהפרוטוקולים המשמשים לבודד את שריר לב חולדה ועכבר בילוד הם כמעט זהים, טיפול גדול יותר יש לקחת בבחירת תמהיל אנזים מתאים לאפשרות השנייה. אכן, שריר לב עכבר בילוד הוא בדרך כלל רגיש יותר לoverdigestion, וכתוצאה מכך תא תשואה וכדאיות מופחתים. יתר על כן, צפיפות ציפוי צריכה להיות מותאמת, כי שריר לב שנלקח מעכברי יילודים הם מעט קטן יותר בהשוואה לתאי שמקורם בלב חולדה בילוד.

עם שימושים רבים לחקירה של פרמטרים מורפולוגיים, אלקטרו, ביוכימיות, תא ביולוגי ויומכנית, כמו גם לתהליך של myofibrillogenesis, שריר לב בילוד בתרבית הפכו לאחד המערכות המגוונות ביותר ללימודפונקציות תא לב במבחנה. הצעד הראשון לassay מוצלח לעומת זאת, תלוי במתודולוגיה קלה ואמינה לבודד את שריר לב עכבר בילוד. הפרוטוקול שלנו שואב את המתודולוגיה שלה ממקורות רבים והיה מותאם לשחזור וחוסן. אנו דנים בגורמים המשפיעים על cardiomyocyte תשואה וכדאיות, ולספק מגוון רחב של אפשרויות לאופטימיזציה של תנאי בידוד והתרבות.

Protocol

ההליך הבא מתאר 16,17 פרוטוקול בן יומיים לבידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד. כל הפתרונות עקרים או עקרים מסונן. כל הכלים הם מעוקרים על ידי עיקור משטח עם 75% אתנול. פרט למיצוי הרקמה הראשוני, כל הצעדים שבוצעו במכסת מנוע בתרבית תא זרימה למינרית סטרילי. פרוטוקול זה מיועד…

Representative Results

באמצעות פרוטוקול זה, אנו מבודדים לבבות מ8 עכברי יום אחד ישן בילוד (איורים 1 א, 1 ב ', משלים הסרט S1). לאחר הכביסה וקוצץ את הלבבות עם מספריים (איורים 1C-1F), שברי רקמה היו מעוכלים מראש במדיום בידוד במשך הלילה על 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. בעקבות predigestion <stro…

Discussion

השימוש במודלים של בעלי חיים כדי ללמוד מחלות לב הפך סטנדרטיים במחקר לב וכלי דם. אפיון ביוכימי קרוב יותר של מודלים אלה (כלומר, לומדים את תגובות ישירות של תאי לב לגירויים ביוכימי או ביומכנית) בדרך כלל דורש הבידוד של רקמות לב או שריר לב. מחקרים חוקרים תגובות פיסיולוגי…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8	Sigma	B-0753	prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.
Collagenase/Dispase	Roche	10269638001	can be substituted with collagenase type II from Worthington
Collagenase type II3	Worthington	CLS-2	substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA	e.g. cellgro	25-053-CI
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS	e.g. cellgro	30-002-Cl
1x PBS (without Ca2+, Mg2+)	e,g, cellgro	21-040-CV
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4	e.g. cellgro	21-022-CV
DMEM high glucose	e.g. cellgro	10-013-CV
M-199	e.g. cellgro	10-060-CV
fetal bovine serum	e.g. cellgro	35-011-CV	cell-culture grade
horse serum	e.g. cellgro	35-030-CV	cell-culture grade
Leibovitz L-155	e.g. cellgro	10-045-CV
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)	Sigma	C-6645	proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C
phenylephrine	Sigma	P-6126	chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
isoproterenol hydrochloride	Sigma	I-6501	chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
0.1% collagen solution	Sigma	C-8919	extracellular matrix for coating
3 mg/ml collagen type 1 solution	Advanced BioMatrix	5005-B	alternative to Sigma collagen solution
cell strainer	e.g. Fisherbrand	22363548	appropriate filter size:40 μm-100 μm
syringe filter 0.2 μm	e.g. Fisherbrand	09-719C	for sterile filtration of digestion medium
straight scissors	e.g. Fine Sciences Tools	91460-11
curved scissors	e.g. Fine Science Tools	91461-11
Dumont No. 7 forceps	e.g. Fine Science Tools	91197-00
perforated spoon	e.g. Fine Science Tools	10370-19	optional, for transfer of heart tissue
Trypan blue	e.g. Gibco	15250-061	live cell staining
Neubauer hemocytometer	e.g. Prosource Scientific	3500	alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems
50 ml Falcon tubes	e.g. Fisherbrand	14-432-23
15 ml Falcon tubes	e.g. Fisherbrand	05-527-90
20 ml syringe	e.g. BD Medical	14-820-19
10 ml serological pipette	e.g. Falcon	357551
30 mm cell culture dish	e.g. Nunc	153066	for standard culture of cardiomyocytes
30 mm cell culture dish, glass bottom	MatTek	P35G-0-10-C	for live cell imaging with inverted microscope
10 cm cell culture dish	e.g. Nunc	172958	for preplating
Escort III	Sigma	L3037	for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000
Lipofectamine 2000	Life Technologies, Invitrogen	52887	substitute for Escort III
			Buffers and media: Isolation medium (filter sterilize) 20 mM BDM 0.0125% trypsin in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+) Digestion medium (filter sterilize) 20 mM BDM 1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix in L15 medium Plating medium 65% DMEM high glucose 19% M-199 10% horse serum 5% fetal calf serum 1% penicillin/streptomycin Maintenance medium 78% DMEM high glucose 17% M-199 4% horse serum 1% penicillin/streptomycin optional: 1 μM AraC 1 μM isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine The plating and maintenance medium can be stored at 4 °C for up to 6 months.