Aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales Ratón

Summary

Los cultivos primarios de cardiomiocitos de ratón son una de las herramientas fundamentales para la investigación de la organización miofibrilar y la función. El siguiente protocolo describe el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos primarios de corazones de ratón neonatales. Los cultivos de cardiomiocitos resultantes pueden usarse posteriormente para una variedad de ensayos biomecánicos, bioquímicos y de células biológica.

Abstract

Cardiomiocitos neonatales cultivadas han sido utilizados para estudiar myofibrillogenesis y funciones miofibrilares. Cardiomiocitos cultivados permiten una fácil investigación y manipulación de las vías bioquímicas, y su efecto sobre las propiedades biomecánicas de latido espontáneo cardiomiocitos.

El siguiente protocolo 2-día describe el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales de ratón. Mostramos cómo diseccionar fácilmente corazones de los recién nacidos, se disocia el tejido cardíaco y enriquecer los cardiomiocitos de la población celular cardiaca. Se discute el uso de diferentes mezclas de enzima para disociación celular, y sus efectos sobre la viabilidad celular. Los cardiomiocitos aislados se pueden utilizar posteriormente para una variedad de ensayos morfológicos, bioquímicos, electrofisiológicos, de células biológica o biomecánico. Hemos optimizado el protocolo para la robustez y reproducibilidad, mediante el uso de soluciones disponibles en el mercado único y la enzima se mezcla que shpoca variabilidad ujo de lote a lote. También nos ocupamos de los problemas más comunes asociados con el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos, y ofrecemos una variedad de opciones para la optimización de las condiciones de aislamiento y cultivo.

Introduction

Los primeros informes de la disociación de éxito y la cultura de las células del corazón de roedores se remonta a la década de 1960 ^1,2. Incluso entonces, Harary y Farley notaron que los cardiomiocitos en cultivo "pueden proporcionar un sistema único para el estudio de los requisitos de la contractilidad periódica [, y pueden] proporcionar un medio de determinar la contribución de las diversas vías metabólicas para el proceso [golpes]". Aunque Harary y Farley cardiomiocitos aislados y cultivados de ratas jóvenes, y el protocolo original se ha adaptado y modificado por muchos científicos en los últimos años, el procedimiento de aislamiento y el cultivo en general no ha cambiado mucho. Sin embargo, mejores enzimas ^3, soluciones normalizadas ^{de 4,5,} y la adición del canal reversible y la miosina ATPasa inhibidor de la BDM para proteger las células durante el procedimiento de aislamiento ^6-9 ha mejorado significativamente celular rendimiento y la viabilidad.

Adultos vs miocardiopatía neonatalcitos

Cardiomiocitos aislados y cultivadas a partir de ratones o ratas neonatales tienen varias ventajas sobre los cultivos de cardiomiocitos adultos. Ante todo, el procedimiento de aislamiento para neonatales de ratón o rata corazones es más fácil y menos costoso, en comparación con el aislamiento de cardiomiocitos de rata o ratón adulto ^10. Cardiomiocitos neonatales son mucho menos sensibles a la reintroducción en un medio que contiene calcio después de la disociación, aumentando enormemente de células-rendimiento. Otra gran ventaja es que los cardiomiocitos de ratones neonatales se someten a una desdiferenciación más rápido – ciclo de re-diferenciación que da lugar típicamente a latir espontáneamente células 20 horas después de la siembra, mientras que los cardiomiocitos adultos suelen requerir de estimulación para inducir la contracción. Cardiomiocitos neonatales son también más fácilmente transfectable con métodos de transfección liposomal, mientras que los cardiomiocitos adultos requieren vectores virales para la entrega exitosa de ADN transgénico. En contraste con los cardiomiocitos neonataless, la cultura de los cardiomiocitos de roedores adultos ^11-13 permite para las investigaciones de la degradación miofibrilar y eventual restablecimiento del aparato contráctil. Estos cambios morfológicos característicos en cardiomiocitos adultos ocurren en períodos de 1 a 2 semanas. La desdiferenciación – ciclo de re-diferenciación está acompañado por la reexpresión del programa genético fetal, imitando así los cambios patológicos observados en las miocardiopatías humanos ^14. Otra ventaja de los cardiomiocitos de ratas adultas sobre la cultura de los cardiomiocitos neonatales es la capacidad de estas células de cultivo durante largos períodos de tiempo.

Rata vs cardiomiocitos de ratón

El aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales de rata tiene algunas ventajas sobre el de los cardiomiocitos neonatales de ratón, incluyendo mayores rendimientos de células viables y aumento de las tasas de transfección. Sin embargo, el amplio uso de los modelos de ratones genéticamente modificados para las enfermedades cardíacas (por ejemplo </ Em> la lim muscular nocaut proteína de ratón como modelo para la miocardiopatía dilatada ¹⁵⁾ ha dado lugar a la adaptación del procedimiento de aislamiento de cardiomiocitos derivados de ratones recién nacidos. Aunque los protocolos utilizados para aislar de rata y ratón cardiomiocitos neonatales son casi idénticos, mayor se debe tener cuidado en la selección de una mezcla de enzima apropiado para este último. De hecho, los cardiomiocitos neonatales de ratón son generalmente más susceptibles a overdigestion, resultando en una célula rendimiento y la viabilidad reducida. Por otra parte, la densidad de placas se debe ajustar, ya que los cardiomiocitos derivados de ratones recién nacidos son algo más pequeñas en comparación con las células derivadas de corazones de ratas neonatales.

Con muchas aplicaciones para la investigación de los parámetros morfológicos, electrofisiológicos, bioquímicos, de células biológicas y biomecánicas, así como para el proceso de myofibrillogenesis, cardiomiocitos neonatales cultivados se han convertido en uno de los sistemas más versátiles para el estudio defunciones de las células cardíacas in vitro. El primer paso para un ensayo de éxito, sin embargo, depende de una metodología sencilla y fiable para aislar los cardiomiocitos de ratones neonatales. Nuestro protocolo se basa su metodología de muchas fuentes y se ha optimizado para la reproducibilidad y robustez. Se discuten los factores que influyen en los cardiomiocitos rendimiento y viabilidad, y ofrecemos una variedad de opciones para la optimización de las condiciones de aislamiento y cultivo.

Protocol

El siguiente procedimiento describe un 16,17 protocolo de dos días para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos de ratones neonatales. Todas las soluciones son estériles o estéril filtrada. Todas las herramientas se esterilizan mediante esterilización de la superficie con etanol al 75%. Excepto para la extracción inicial del tejido, todas las medidas se llevan a cabo en una campana de cultivo de células de flujo laminar estéril. Este protocolo está diseñado para el aislamiento de corazones neonata…

Representative Results

El uso de este protocolo, se aislaron los corazones de 8 un día de edad ratones recién nacidos (Figuras 1A, 1B, Supplemental Película S1). Después de lavar y picar los corazones con las tijeras (figuras 1C-1F), fragmentos de tejido fueron predigerido en medio de aislamiento durante la noche a 4 ° C con agitación suave. Siguiendo predigestion (Figura 1G), transferimos los fragmentos de tejido en un medio de digestión recién hecho, y se incubaron los fragmentos de…

Discussion

El uso de modelos animales para estudiar las enfermedades cardíacas se ha convertido en estándar en la investigación cardiovascular. Más cerca de la caracterización bioquímica de estos modelos (es decir, el estudio de respuestas directas de las células cardíacas a los estímulos bioquímicos o biomecánicos) típicamente requiere el aislamiento de los tejidos del corazón o los cardiomiocitos. Los estudios que investigan las respuestas fisiológicas del corazón ex vivo (por ejemplo, a la aceti…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8	Sigma	B-0753	prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.
Collagenase/Dispase	Roche	10269638001	can be substituted with collagenase type II from Worthington
Collagenase type II3	Worthington	CLS-2	substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA	e.g. cellgro	25-053-CI
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS	e.g. cellgro	30-002-Cl
1x PBS (without Ca2+, Mg2+)	e,g, cellgro	21-040-CV
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4	e.g. cellgro	21-022-CV
DMEM high glucose	e.g. cellgro	10-013-CV
M-199	e.g. cellgro	10-060-CV
fetal bovine serum	e.g. cellgro	35-011-CV	cell-culture grade
horse serum	e.g. cellgro	35-030-CV	cell-culture grade
Leibovitz L-155	e.g. cellgro	10-045-CV
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)	Sigma	C-6645	proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C
phenylephrine	Sigma	P-6126	chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
isoproterenol hydrochloride	Sigma	I-6501	chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
0.1% collagen solution	Sigma	C-8919	extracellular matrix for coating
3 mg/ml collagen type 1 solution	Advanced BioMatrix	5005-B	alternative to Sigma collagen solution
cell strainer	e.g. Fisherbrand	22363548	appropriate filter size:40 μm-100 μm
syringe filter 0.2 μm	e.g. Fisherbrand	09-719C	for sterile filtration of digestion medium
straight scissors	e.g. Fine Sciences Tools	91460-11
curved scissors	e.g. Fine Science Tools	91461-11
Dumont No. 7 forceps	e.g. Fine Science Tools	91197-00
perforated spoon	e.g. Fine Science Tools	10370-19	optional, for transfer of heart tissue
Trypan blue	e.g. Gibco	15250-061	live cell staining
Neubauer hemocytometer	e.g. Prosource Scientific	3500	alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems
50 ml Falcon tubes	e.g. Fisherbrand	14-432-23
15 ml Falcon tubes	e.g. Fisherbrand	05-527-90
20 ml syringe	e.g. BD Medical	14-820-19
10 ml serological pipette	e.g. Falcon	357551
30 mm cell culture dish	e.g. Nunc	153066	for standard culture of cardiomyocytes
30 mm cell culture dish, glass bottom	MatTek	P35G-0-10-C	for live cell imaging with inverted microscope
10 cm cell culture dish	e.g. Nunc	172958	for preplating
Escort III	Sigma	L3037	for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000
Lipofectamine 2000	Life Technologies, Invitrogen	52887	substitute for Escort III
			Buffers and media: Isolation medium (filter sterilize) 20 mM BDM 0.0125% trypsin in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+) Digestion medium (filter sterilize) 20 mM BDM 1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix in L15 medium Plating medium 65% DMEM high glucose 19% M-199 10% horse serum 5% fetal calf serum 1% penicillin/streptomycin Maintenance medium 78% DMEM high glucose 17% M-199 4% horse serum 1% penicillin/streptomycin optional: 1 μM AraC 1 μM isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine The plating and maintenance medium can be stored at 4 °C for up to 6 months.