細胞培養におけるRNA合成、処理およびディケイの高解像度遺伝子発現プロファイリングのための新規転写されたRNAの代謝標識
Summary
全細胞RNAは、短期的RNA合成と崩壊の変化と同様に、RNAプロセシングの動態を研究するための貧乏人のテンプレートが用意されています。ここでは、これらの制限を克服することができ、新たに転写されたRNAのチオール特有のビオチン化および精製し、4 – チオウリジンと新しく転写されたRNAの代謝標識を記述します。
Abstract
全トランスクリプトームマイクロアレイや次世代シーケンシングの開発は、細胞の遺伝子発現の複雑さの理解に革命をもたらしました。関与する分子機構の理解を深めるとともに、下地動態の正確な測定がますます重要になってきた。ここでは、これらの強力な方法論は、テンプレートサンプルそれら研究、 すなわち全細胞RNAの本質的な特性のための主要な制限に直面しています。多くの場合、全細胞RNAの変化が十分な解像度で、基礎となる分子事象とその動態を表現するためにいずれか遅すぎるか早すぎる起こる。また、RNA合成、加工、及び減衰の変化の寄与を容易に区別されていない。
最近では、これらの制限を克服するために、高解像度の遺伝子発現プロファイリングを開発した。我々のアプローチは、4 thiouriで新しく転写されたRNAの代謝標識に基づいていますチオール – 特異的ビオチンとストレプトアビジンでコートした磁気ビーズを使用して、新しく転写されたRNAの厳格な精製しダイン（ひいては4SUタグ付けとも呼ばれる）。それは、脊椎動物、 ショウジョウバエ 、および酵母を含む生物の広い範囲に適用可能である。我々は正常、転写因子活性のリアルタイム動態を研究するRNA半減期の正確な測定を提供し、RNAプロセシングの動態に新規な洞察を得るために4SUタギングを適用した。最後に、計算モデルは、基礎となる分子機構の統合された包括的分析を生成するために使用することができる。
Introduction
遺伝子発現プロファイリングは、細胞プロセス及び関連する複雑な相互作用ネットワークを研究するために使用される重要なツールである。 mRNAの存在量に関する研究は、通常、基礎となる分子メカニズムに基本的な洞察を得るための最適な方法となっている。全トランスクリプトームマイクロアレイ1と、RNA（RNA-seqの）2-4より最近では、次世代シーケンスの開発は、このアプローチを燃料とする。これらの技術は、細胞の遺伝子発現の複雑さの理解に革命をもたらしているが、彼 らは、テンプレートサンプル、 すなわち全細胞RNAの本質的な特性のための主要な制限に直面しています。トータルRNAレベルで最初の、短期的な変化は、転写率の変化と一致していませんが、それぞれの転写産物のRNAの半減期に本質的に依存している。転写因子のための短命のトランスクリプト、 例えばエンコードの五倍誘導は、トータルRNAで容易に検出される一方時間以内に、長命の転写産物の同じ誘導、代謝酵素のための例えばエンコードは、実質的には不可視のままです。加えて、たとえ完全なシャットダウン（> 1,000倍ダウンレギュレーション）五時間のRNAの半減期と平均遺伝子の転写率は、単にだけ二重減少するために、その全RNAレベルに5時間かかりますで。従って、トータルRNAの分析は、調節機能5と転写因子や遺伝子をコードする多くは短命転写産物のアップレギュレーションの検出に有利で ある。また、規制の真の運動カスケードが隠されている、プライマリシグナリングイベントは二次と区別することはできません。両方、順番に、下流のバイオインフォマティクス解析の大幅な偏りが生じる可能性があります。第二に、トータルRNAレベルの変化は、RNAの合成または減衰の変化に起因することはできません。後者の測定はtranscriptiをブロック細胞侵襲アプローチ、 などを必要とするアクチノマイシンD 6、そして時間をかけて継続的なRNA崩壊の拡張監視を使用してください。 5の哺乳類細胞における平均mRNAの半減期で- 10時間5,7、ほとんどの遺伝子のmRNAレベルは、二重転写逮捕の数時間後に未満減少しております。これらむしろ小さな違いは、基礎となる数学の方程式の指数関数的性質に起因する細胞遺伝子の大多数のmRNAの半減期の著しく不正確な測定値になる。我々の遺伝子の約半分が選択的スプライシングイベント8の対象であることを最後に、全細胞RNAのRNA-seqのが明らかになっている間には、基本となる動力学と同様、組織とRNAプロセシングのコンテキスト固有の規制を導くダイナミックメカニズムはよくわかっていないままです。また、特に非コーディングRNA用の差動遺伝子発現に対する処理RNAの寄与は、決定されていない。要するに、これらの制限のためには大きな障害を表す基盤となる分子機構のバイオインフォマティクス運動モデリング。
我々は、最近のアプローチを開発し、これらの問題を克服するために、5,7,9、高解像度の遺伝子発現プロファイリングと呼ばれる。なお、4 -チオウリジン（4SUタギング）、天然に存在するウリジン誘導体を使用して、新しく転写されたRNAの代謝標識に基づいており、細胞増殖および遺伝子発現の干渉を最小限（ 図1参照）5と新たに転写された転写物への直接アクセスを提供する10-12。その急速な取り込み、4SU-三リン酸へのリン酸化、および新たに転写されたRNAへの取り込みにおける4SU結果に真核細胞の暴露。全細胞RNAの単離の後、4SU-標識されたRNA画分はチオール – 特異的ビオチンと新たに転写されたRNA間のジスルフィド結合を生成するビオチン化される。 '全細胞RNA'は、その後、定量的にラベル分け（ '新たに転写'）とラベル付けされていない（ 'プレexistinすることができますストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズを用いて高純度グラム '）RNA。最後に、標識されたRNAは、単にジスルフィド結合を切断する還元剤（ 例えば、ジチオスレイトール）を添加し、ビーズから新たに転写されたRNAを解放することによってビーズから回収される。
新たに転写されたRNAは4SU暴露期間中にすべての遺伝子の転写活性を示しています。分のタイムスケールで4SUタギングは、このように、真核生物の遺伝子発現のスナップ写真とダウンストリームバイオインフォマティクス解析（ 例えばプロモーター解析）のための理想的なテンプレートを提供しています。定常状態が想定される場合、新たに転写/合計の比率では、新たに転写/非標識及び非標識/全RNAは、正確なRNAの半減期7,13への非侵襲的なアクセスを提供します。また、4SUタギング（5分4SU-RNA）の、わずか5分で15歳未満と60分4SU-RNAである。後精製し、その新たに転写されたRNAを注意することが重要です超短と次第に長く4SUタギングRNA-seqのと組み合わせて、単一の実験設定で両方を行う場合は、RNAプロセシングの動態は、ヌクレオチド分解能9で明らかにされています。最後に、計算モデルと組み合わせて新たに転写され、総RNAの経時的分析は、RNA合成と崩壊14の統合的な分析を可能にする。
結論として、このアプローチは、真核細胞におけるRNA合成、加工、及び劣化のダイナミクス直接分析を可能にする。これは、哺乳類、昆虫（ ショウジョウバエ ）、両生類（ アフリカツメガエル ）、および酵母5,15,16を含むすべての主要なモデル生物で適用されます。これは、マイクロアレイ解析5,17、RNA-seqの9,13,14と直接互換性があり、 生体内で 12,15 に適用されます。ここでは、詳細な方法論を、ラベルを分離、培養した哺乳動物細胞で新たに転写されたRNAを精製する。また、ポテンショらの問題や落とし穴が議論されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
新たに転写されたRNAの代謝標識は、実質的に興味のある生物学的な問題に対処するためのより適切なテンプレートを提供することで、マイクロアレイとRNA-seqのようなハイスループット技術の能力を強化しています。現在のプロトコルでは、広範な最適化を行った。これは、新たに転写されたRNAの> 1,000倍濃縮を可能にし、再現性の高い結果を提供します。
新たに転写さ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、原稿を注意深く読むためアミエリーガンに感謝したいと思います。この作品は、CCFにLDとDFG助成FR2938/1-1にNGFNプラス助成金＃01GS0801、MRCフェローシップ助成G1002523とNHSBT助成WP11-05でサポートされていました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-thiouridine | Carbosynth | T4509 | Prepare 50 mM stock in sterile H2O, store at -20 °C in aliquots of 50-500 μl, discard unused reagent, do not refreeze. |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml) | WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol); Store at 4 °C. |
| Chloroform | Sigma | 372978 | WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH |
| Isopropanol | Sigma | 650447 | |
| Sodium citrate, nuclease-free | Sigma | C8532 | Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water. |
| 5M nuclease-free NaCl | Sigma | 71386 | Stock solution |
| Nuclease-free H2O | Sigma | W4502 | Make 1 ml aliquots in nuclease-free tubes. |
| RNA precipitation buffer | 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under strictly nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes. | ||
| Ethanol | Sigma | 459844 | Use with nuclease-free water to prepare 80% ethanol, store at -20 °C. |
| 1 M nuclease-free Tris Cl, pH 7.5 | Lonza | 51237 | Stock solution |
| 500 mM nuclease-free EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | Stock solution |
| 10x Biotinylation Buffer (BB) | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water, make aliquots of 1 ml. | ||
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | D4551 | |
| EZ-Link biotin-HPDP | Pierce | 21341 | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 °C in aliquots of 1 ml. |
| Phase Lock Gel Heavy tubes 2.0 ml | Eppendorf | 0032 005.152 | Optional for the chloroform extraction step. |
| Zeta membrane | BIORAD | 162-0153 | |
| 10x Dot blot binding buffer | 100 mM NaOH, 10 mM EDTA | ||
| Biotin-oligo | 5′-biotin, 25 nucleotides, any sequence | ||
| Sodium dodecyl sulphate | Fisher | BPE9738 | For 100 ml 20% stock solution, add 20 g SDS to 80 ml PBS pH 7-8 and adjust volume to 100 ml. Keep all high-percentage SDS solutions above 20 °C. Warm the solutions slightly should SDS precipitate. |
| EZ-Link Iodoacetyl-LC-Biotin | Pierce | 21333 | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg iodoacetyl-biotin in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 °C in aliquots of 1 ml. Generates irreversible, thiol-specific biotinylation. |
| Phosphate buffer saline | Gibco | 10010-015 | |
| Dot blot blocking buffer | Mix 20 ml 20% SDS with 20 ml 1 x PBS pH 7-8 and add EDTA to the final concentration of 1 mM. | ||
| Streptavidin-horseradish peroxidase | Vector Laboratories | SA5004 | Store at -20 °C. Mix 10 ml 20% SDS with 10 ml 1 x PBS. Add 20 μl Streptavidin-HRP before use. |
| ECL reagent | GE Healthcare | RNP2109 | Use following the manufacturer’s instructions. |
| Super RX, X-RA Film, 18×24 cm | Fujifilm | 47410 19236 | |
| μMacs Streptavidin Kit | Miltenyi | 130-074-101 | Store the beads at 4 °C. |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Washing buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O. | ||
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43817 | Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O, always prepare fresh before use. |
| RNeasy MinElute Kit | Qiagen | 74204 | Store columns at 4 °C, remaining components of the kit at room temperature. |
| 1.5 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72.692.005 | Compatible with Dimethylformamide |
| 2.0 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72.694.005 | Compatible with Dimethylformamide |
| 15 ml tubes | BD Falcon | 352096 | Compatible with Dimethylformamide |
| 50 ml tubes | BD Falcon | 352070 | Compatible with Dimethylformamide |
| All solutions/reagents should be stored at room temperature unless otherwise specified. | |||
| Equipment | |||
| UV/VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 1000 | Or equivalent. Use low volume (1-2 μl) for measurements of low RNA concentrations to avoid excessive sample loss. |
| Polypropylene 15 ml centrifuge tubes | VWR International | 525-0153 | In contrast to standard 15 ml tubes, these tolerate up to 15,000 × g |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g |
| High-speed rotor | Beckman Coulter | JLA-16250 | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g |
| Adaptors for 15 ml tubes | Laborgeräte Beranek | 356964 | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g |
| Refrigerated table-top centrifuge | Eppendorf | 5430 R | Or equivalent. |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer compact | Or equivalent. |
| Magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | One stand holds 8 μMacs columns. |
| Waterbath | Grant | SUB Aqua 5 | Or equivalent. |
| Ultra-fine scale | A&D | GR-202 | Or equivalent. |
| E-Gel iBase Power System | Invitrogen | G6400UK | For RNA gels; or equivalent. |
| E-Gel EX 1% agarose precast gels | Invitrogen | G4020-01 | For RNA gels; or equivalent. |
Referências
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