В пробирке Organoid культуры первичных опухолей толстой мыши
Summary
Простой способ создать первичные мышиные опухоли толстой кишки органоид описано. Этот метод использует функцию, что клетки опухоли толстой кишки выжить и развиваться в органоидов в средах, содержащих ограниченные факторы роста, в то время как нормальные эпителиальные толстой кишки нет.
Abstract
Несколько человеческих и мышиных толстой линии раковых клеток были созданы, физиологической целостности опухоли толстой кишки, таких как несколько слоев клеток, базально-апикальном полярность, способность различать, и аноикис не поддерживаются при раке толстой кишки клеточных линиях. Данное исследование демонстрирует способ для культивирования первичной опухоли толстой кишки мыши органоидами адаптировано из Sato T и соавт. 1, который сохраняет важные физиологические особенности опухолей толстой кишки. Этот метод состоит в толстой кишки мыши опухолевой ткани сбора, прилегающий нормальной толстой кишки эпителия диссоциации, толстой кишки опухолевых клеток пищеварение на отдельные клетки, клетки встраивания опухоли толстой кишки в матригеле, и селективное культуры, основанной на принципе, что опухолевые клетки поддерживать рост на ограничение питательных условий по сравнению с нормальными эпителиальных клеток.
Первичная опухоль органоидами если изолированы от генетически модифицированных мышей обеспечивают очень полезная система для оценки опухоли автономных функцион специфических генов. Кроме того, опухоли органоидами поддаются генетических манипуляций вирусом медитировал доставки генов, поэтому сигнальные пути, участвующие в толстой кишке туморогенез также может быть широко исследованы экспрессией или нокдаун. Первичная опухоль органоидами культура обеспечивает физиологическую актуальны и доступное средство для изучения механизмов и терапевтических методик для туморогенез толстой кишки.
Introduction
Кишечные эпителиальные клетки размножаются и перевернуть на внеочередной скоростью, опережая всех других тканей в теле позвоночных 2,3. Деления клеток, включая стволовые клетки кишечника (ISC) и транзита усиления клетки дифференцируются в секреторных либо (бокал, Панетом и энтероэндокринных) клетки или энтероцитов 3. ISC расположена в основании крипт. Панетом клетки перемещаются вниз к основанию крипт и долговечны, тогда как других линий мигрировать вверх к 3,4 ворсинки. Здесь клетки подвергаются воздействию содержимого кишечника в том числе микробиоты и навес с ворсинок советы через аноикис индуцированный механизм апоптоза. Несмотря на то, толстой кишки не хватает ворсинок и Панетом клетки, механизм для поддержания гомеостаза аналогична 4.
Сигнального пути Wnt участвует в играющих решающую роль в пролиферации и кишечной ISC обслуживание 4. Удаление йэлектронной фактора транскрипции TCF4, нижестоящим эффектором Wnt сигнализации, приводит к потере кишечных стволовых клеток и последующего распада ткани 5. Аналогично, трансгенной экспрессии гена Wnt DKK1 ингибитор снижает пролиферацию эпителиальных и истощает линий секреторными клетками, 6. И наоборот, избыточная экспрессия Wnt агонист R-spondin-1 индуцирует сильный и быстрым распространением кишечных клеток крипты 7.
Учитывая важность Wnt сигнализации для кишечных гомеостаз, Wnt пути мутации часто наблюдается при раке толстой кишки 8. Рак толстой кишки является третьей ведущей причиной смерти от рака в США 9. Избыток пищевого рациона с красным мясом и алкоголем, снижение физической активности, и унаследовал и соматические мутации считаются факторами риска рака толстой кишки 10,11. Аденоматозное полипозу палочка (APC) гена, ключевой фактор Wnt сигнализации, мутирует в большинстве годовыхПациенты с семейным, спорадический характер, и колиты связанных рака толстой кишки 12,13. Мутации других факторов, влияющих на сигнальный путь Wnt включая Axin2 и β-катенина наблюдаются также при раке толстой кишки 14,15. Тем не менее, точный механизм, и эффективная терапия для рака толстой кишки все еще отсутствуют. Для облегчения исследования молекулярных механизмов для рака толстой кишки, рака толстой кишки человека клеточных линий, представляющих различные стадии прогрессии рака от доброкачественных к агрессивному типу клеток были созданы 16-18 лет. Мышь клеток карциномы ободочной кишки линии с различными метастатических свойств также доступны 19,20. Тем не менее, первичные элементы или органоид культур предпочтительнее трансформированные клеточные линии, потому что они точно имитировать в естественных условиях и состоянии генерировать больше физиологически соответствующие данные 21. Большинство рак толстой кишки-клеточных линиях расти как монослой прикреплены к пластине или как клеточная суспензия, lackinг-апикальные базолатеральным ориентации и плотных контактов между клетками. Кроме того, нормальных и опухолевых клеток эпителия кишечника в естественных условиях подвергаются спонтанной формой называется апоптозом аноикис как дифференцированные клетки достигают ворсинок советы и опадает 22. Эти особенности трудно резюмировать в клеточных линиях, но играют важную роль в процессе развития рака толстой кишки 23. Эти функции поддерживаются в первичных органоидов. Кроме того, культуры опухолевых органоидные обеспечить эффективную систему оценки опухоли автономных функций генов по сравнению с в естественных условиях исследования. Генетические манипуляции в естественных условиях кишечника является трудоемким процессом в основном за счет создания трансгенных и / или нокаутом кишечнике мышей с использованием конкретных драйверов. Тем не менее, опухоль органоиды которые несложно вирусных опосредованной генетических манипуляций и таким образом отличный инструмент для оценки точные молекулярные механизмы. Первичные опухоли кишечного культур органоид ВГАэлектронной Было продемонстрировано, что возможно и мощная техника. Первичные культуры клеток кишечного может установить функциональные кишечные органоидами с Crypt-структуры ворсинок в пробирке из одного взрослого Lgr5 + стволовых клеток 24. Эти органоиды можно пересаживать и привиты в поврежденные ткани толстой кишки для регенерации 25. Далее адаптации условий культивирования сделал подобный эпителиальных органоидами из толстой кишки мыши и человека тонкого и толстого кишечника возможным 1. Для первичной культуры нормальных эпителий толстой кишки, основной культуральной среде, а также факторы роста, в том числе EGF, Noggin, R-spondin и Wnt3a являются существенными, в то время как основной культуральной среде и EGF достаточна для выращивания первичной органоидами толстой кишки мыши опухоли 1. Здесь мы опишем подробный протокол, чтобы изолировать, культуры, а также генерировать органоидами опухоли толстой кишки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Экспериментальные процедуры, описанные в данном протоколе позволит обеспечить изоляцию и культуры первичных мышиных опухолей толстой кишки. Протокол адаптирован из семенных работу д-ра Clevers группы 1,24,27. Мы оптимизировали время пищеварения и концентрации коллагеназы, чтобы полу…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами для YMS из Национального института здоровья (CA148828), Мичиганский университет Желудочно-кишечный пептид центр, и Джеффри А. Колби исследований рака толстой кишки и Тома Лю Мемориал фондов Мичиганского университета онкологический центр Всеобъемлющее.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 356234 | 5 mg/ml |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | 375 U/mg |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | 1.8 U/mg |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF), Murine, Natural | Invitrogen | 53003-018 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100 x |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | 50 x |
| Glutamax-I | Gibco | 35050-079 | 100x |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | |
| PicoPureTM RNA Isolation Kit | Invitrogen | KIT0204 |
Referências
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Creamer, B., Shorter, R. G., Bamforth, J. The turnover and shedding of epithelial cells. I. The turnover in the gastro-intestinal tract. Gut. 2, 110-118 (1961).
- Crosnier, C., Stamataki, D., Lewis, J. Organizing cell renewal in the intestine: stem cells, signals and combinatorial control. Nat. Rev. Genet. 7, 349-359 (2006).
- Medema, J. P., Vermeulen, L. Microenvironmental regulation of stem cells in intestinal homeostasis and cancer. Nature. 474, 318-326 (2011).
- Korinek, V., et al. Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4. Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).
- Pinto, D., Gregorieff, A., Begthel, H., Clevers, H. Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium. Genes Dev. 17, 1709-1713 (2003).
- Kim, K. A., et al. Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium. Science. 309, 1256-1259 (2005).
- Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics, 2012. CA Cancer J. Clin. 62, 10-29 (2012).
- Sesink, A. L., Termont, D. S., Kleibeuker, J. H., Vander Meer, R. Red meat and colon cancer: the cytotoxic and hyperproliferative effects of dietary heme. Cancer Res. 59, 5704-5709 (1999).
- Fearon, E. R. Molecular genetics of colorectal cancer. Annu. Rev. Pathol. 6, 479-507 (2011).
- Nishisho, I., et al. Mutations of chromosome 5q21 genes in FAP and colorectal cancer patients. Science. 253, 665-669 (1991).
- Xue, X., et al. Hypoxia-inducible factor-2alpha activation promotes colorectal cancer progression by dysregulating iron homeostasis. Cancer Res. 72, 2285-2293 (2012).
- Liu, W., et al. Mutations in AXIN2 cause colorectal cancer with defective mismatch repair by activating beta-catenin/TCF signalling. Nat. Genet. 26, 146-147 (2000).
- Morin, P. J., et al. Activation of beta-catenin-Tcf signaling in colon cancer by mutations in beta-catenin or APC. Science. 275, 1787-1790 (1997).
- Brattain, M. G., Fine, W. D., Khaled, F. M., Thompson, J., Brattain, D. E. Heterogeneity of malignant cells from a human colonic carcinoma. Cancer Res. 41, 1751-1756 (1981).
- Leibovitz, A., et al. Classification of human colorectal adenocarcinoma cell lines. Cancer Res. 36, 4562-4569 (1976).
- Willson, J. K., Bittner, G. N., Oberley, T. D., Meisner, L. F., Weese, J. L. Cell culture of human colon adenomas and carcinomas. Cancer Res. 47, 2704-2713 (1987).
- Brattain, M. G., Strobel-Stevens, J., Fine, D., Webb, M., Sarrif, A. M. Establishment of mouse colonic carcinoma cell lines with different metastatic properties. Cancer Res. 40, 2142-2146 (1980).
- Ikubo, A., Aoki, Y., Nagai, E., Suzuki, T. Highly metastatic variant of a mouse colon carcinoma cell line, LM17 and its response to GM-CSF gene therapy. Clin. Exp. Metastasis. 17, 849-855 (1999).
- Basant, S. K., Rinesh, K. Principles Of Animal Cell Culture. Student Compendium. Textbook Student Edition. 6, 61-96 (2008).
- Vachon, P. H., et al. Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis. Gastroenterology. 123, 1980-1991 (2002).
- Darido, C., et al. Defective claudin-7 regulation by Tcf-4 and Sox-9 disrupts the polarity and increases the tumorigenicity of colorectal cancer cells. Cancer Res. 68, 4258-4268 (2008).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Yui, S., et al. Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5(+) stem cell. Nat. Med. 18, 618-623 (2012).
- Anderson, E. R., Xue, X., Shah, Y. M. Intestinal hypoxia-inducible factor-2alpha (HIF-2alpha) is critical for efficient erythropoiesis. J. Biol. Chem. 286, 19533-19540 (2011).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Kondo, J., et al. Retaining cell-cell contact enables preparation and culture of spheroids composed of pure primary cancer cells from colorectal cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 6235-6240 (2011).
- Clevers, H., Nusse, R. Wnt/beta-catenin signaling and disease. Cell. 149, 1192-1205 (2012).
