في المختبر الثقافة عضوي من أورام القولون ماوس
Summary
يوصف وهناك طريقة بسيطة لإنشاء الابتدائي الفئران القولون عضوي الورم. هذا الأسلوب يستخدم ميزة أن الخلايا السرطانية القولون البقاء على قيد الحياة وتنمو لتصبح organoids في وسائل الإعلام التي تحتوي على عوامل النمو محدودة، في حين القولون العادي الظهارية لا.
Abstract
وقد وضعت العديد من خطوط الخلايا السرطانية القولون الإنسان والفئران، لا يتم الاحتفاظ سلامة فيزيولوجي من أورام القولون مثل طبقات متعددة الخلية، قطبية القاعدية القمي، والقدرة على التمييز، وanoikis في سرطان خطوط الخلايا المشتقة القولون. يوضح هذه الدراسة طريقة لزراعة الأولية الماوس القولون organoids ورم مقتبس من ساتو T وآخرون. 1، الذي يحتفظ ميزات فيزيولوجي مهم من أورام القولون. يتكون هذا الأسلوب من القولون جمع الماوس ورم الأنسجة المجاورة ظهارة القولون العادي تفارق والقولون ورم خلايا الهضم داخل الخلايا واحد، تضمين الخلايا السرطانية في القولون matrigel، وثقافة انتقائية تقوم على مبدأ أن الخلايا السرطانية الحفاظ على النمو على الحد من الظروف المغذيات مقارنة إلى وضعها الطبيعي الخلايا الظهارية.
وorganoids الورم الرئيسي إذا المعزولة من الفئران المعدلة وراثيا توفير نظام مفيد جدا لتقييم FUNCT مستقلة ورمأيون من جينات معينة. وعلاوة على ذلك، فإن organoids الورم قابلة للتلاعب الجيني بواسطة فيروس التأمل توصيل الجينات؛ مسارات بالتالي يشير تشارك في تكون الأورام القولون ويمكن أيضا أن يتم التحقيق على نطاق واسع من قبل من overexpression أو ضربة قاضية. يوفر الابتدائي ورم ثقافة organoids وسيلة الفسيولوجية ذات الصلة ومجدية لدراسة الآليات والطرائق العلاجية لتكون الأورام القولون.
Introduction
الخلايا الظهارية في الأمعاء تتكاثر وتسليم بمعدل غير عادي، متجاوزا جميع الأنسجة الأخرى في الجسم الفقاريات 2،3. وتقسيم الخلايا بما في ذلك الخلايا الجذعية المعوية (ISC) والعبور تضخيم الخلايا تفرق في إما إفرازي (القدح، بانيت وenteroendocrine) أو الخلايا المعوية 3. يقع ISC في قاعدة سرداب. خلايا بانيت تحريك لأسفل إلى الجزء السفلي من الخبايا وتكون طويلة الأمد، في حين الأنساب الأخرى تهاجر نحو الأعلي للالزغب 3،4. هنا تتعرض الخلايا لمحتويات القناة الهضمية بما في ذلك مجهريات البقعة ويتم تسليط من النصائح زغابة من خلال آلية أفكارك anoikis التي يسببها. على الرغم من أن القولون يفتقر الزغب والخلايا بانيت، وآلية للحفاظ على التوازن مشابه 4.
وقد تورط مسار الإشارات WNT في لعب دورا حاسما في انتشار المعوية والصيانة ISC 4. حذف من اله عامل النسخ TCF4، وهو المستجيب المصب من إشارات WNT، يؤدي إلى فقدان الخلايا الجذعية المعوية والانهيار اللاحق للنسيج 5. وبالمثل، التعبير المعدلة وراثيا من DKK1 المانع WNT يقلل من انتشار الظهارية ويستنزف الأنساب الخلية الإفرازية 6. وعلى العكس، overexpression من ناهض WNT R-spondin-1 الحث انتشار قوي والسريع للخلايا المعوية سرداب 7.
ونظرا لأهمية إشارات WNT لتوازن الأمعاء، وكثيرا ما لوحظ الطفرات مسار WNT في سرطان القولون 8. سرطان القولون هو ثالث سبب رئيسي للوفاة من السرطان في الولايات المتحدة 9. المدخول الغذائي الزائدة مع اللحوم الحمراء والكحول، انخفاض النشاط البدني، والموروثة وتعتبر الطفرات الجسدية لتكون عوامل خطر الإصابة بسرطان القولون 10،11. وتحور القولونية المرجلات غدومي (APC) الجينات، عاملا رئيسيا إشارات WNT، في أغلبية السلطة الفلسطينيةtients مع العائلية، متفرقة، والتهاب القولون المرتبط بسرطان القولون 12،13. ويلاحظ الطفرات من العوامل الأخرى المشاركة في WNT مسار الإشارات بما في ذلك Axin2 وβ كاتينين أيضا في سرطان القولون 14،15. ومع ذلك، فإن آلية دقيقة وعلاج فعال لسرطان القولون لا تزال تفتقر. لتسهيل التحقيق في الآليات الجزيئية لسرطان القولون، تم إنشاء خطوط الخلايا البشرية سرطان القولون تمثل مراحل مختلفة من تطور السرطان من حميدة إلى نوع من الخلايا العدوانية 16-18. الماوس القولون خطوط الخلايا السرطانية مع خصائص النقيلي مختلفة متوفرة 19،20 أيضا. ومع ذلك، ويفضل الخلايا الأولية أو الثقافات عضوي أكثر من خطوط الخلايا تحولت لأنها تحاكي عن كثب في حالة الجسم الحي وتوليد المزيد من البيانات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية 21. معظم القولون وسرطان خطوط الخلايا المشتقة تنمو كما أحادي الطبقة التي تعلق على لوحة أو الايقاف الخلية، lackinز من التوجه قمية-basolateral ومنعطفات ضيقة بين الخلايا. أيضا، والخلايا الظهارية في الأمعاء العادية والورم في الجسم الحي الخضوع لشكل عفوي من موت الخلايا المبرمج anoikis توصف بأنها خلايا متمايزة تصل إلى نصائح زغابة ويتم تسليط 22. هذه الميزات يصعب ألخص في خطوط الخلايا ولكنها مهمة في العملية التنموية من سرطان القولون 23. تتم المحافظة على هذه الميزات في organoids الأولية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الثقافات عضوي ورم توفير نظام فعال لتقييم وظائف مستقلة ورم من الجينات مقارنة في الدراسات المجراة. التلاعب الجيني في الجسم الحي من الأمعاء هي عملية تستغرق وقتا طويلا ولا سيما من خلال خلق المعدلة وراثيا و / أو الفئران خروج المغلوب باستخدام برامج تشغيل الأمعاء محددة. ومع ذلك، فإن organoids الورم قابلة بسهولة لالفيروسية التلاعب الجيني بوساطة وبالتالي أداة عظيمة لتقييم الآليات الجزيئية الدقيقة. الأولية المعوية الثقافات عضوي ورم هفثبت الإلكترونية لتكون تقنية مجدية وقوية. يمكن زراعة الخلايا المعوية الأولية إنشاء organoids المعوية وظيفية مع هيكل سرداب-الزغب في المختبر من بالغ واحد Lgr5 + الخلايا الجذعية 24. هذه organoids يمكن زرعها والمغروسة في الأنسجة التالفة القولون لتجديد 25. قد مزيد من الشروط ثقافة التكيف جعلت organoids الظهارية مماثلة من القولون والأمعاء الدقيقة الماوس الإنسان والقولون مجدية 1. للتعليم الابتدائي العادي القولون ظهارة الثقافة، ثقافة المتوسط القاعدية، فضلا عن عوامل النمو بما في ذلك صندوق تعديل العولمة الأوروبي، رأس، R-spondin وWnt3a ضرورية، في حين بصل متوسطة الثقافة وصندوق تعديل العولمة الأوروبي يكفي لزراعة الماوس القولون organoids الورم الرئيسي 1. نحن هنا وصف بروتوكول مفصلة لعزل، والثقافة، وتوليد organoids ورم القولون.
Protocol
Representative Results
Discussion
فإن الإجراءات التجريبية الموصوفة في هذا البروتوكول إتاحة العزلة والثقافة من أورام القولون الفئران الأولية. ويتم تكييف البروتوكول من العمل المنوي القيام به من قبل الدكتور كليفرز مجموعة 1،24،27. نحن الأمثل الوقت الهضم والتركيز كولاجيناز للحصول على محصول أفضل من o…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة من المنح المقدمة إلى YMS من المعاهد الوطنية للصحة (CA148828)، وجامعة ميشيغان الببتيد مركز الجهاز الهضمي، وجيفري A. كولبي سرطان القولون البحوث وليو صناديق توم التذكارية لمركز السرطان الشامل جامعة ميشيغان.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 356234 | 5 mg/ml |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | 375 U/mg |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | 1.8 U/mg |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF), Murine, Natural | Invitrogen | 53003-018 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100 x |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | 50 x |
| Glutamax-I | Gibco | 35050-079 | 100x |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | |
| PicoPureTM RNA Isolation Kit | Invitrogen | KIT0204 |
Referências
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Creamer, B., Shorter, R. G., Bamforth, J. The turnover and shedding of epithelial cells. I. The turnover in the gastro-intestinal tract. Gut. 2, 110-118 (1961).
- Crosnier, C., Stamataki, D., Lewis, J. Organizing cell renewal in the intestine: stem cells, signals and combinatorial control. Nat. Rev. Genet. 7, 349-359 (2006).
- Medema, J. P., Vermeulen, L. Microenvironmental regulation of stem cells in intestinal homeostasis and cancer. Nature. 474, 318-326 (2011).
- Korinek, V., et al. Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4. Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).
- Pinto, D., Gregorieff, A., Begthel, H., Clevers, H. Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium. Genes Dev. 17, 1709-1713 (2003).
- Kim, K. A., et al. Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium. Science. 309, 1256-1259 (2005).
- Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics, 2012. CA Cancer J. Clin. 62, 10-29 (2012).
- Sesink, A. L., Termont, D. S., Kleibeuker, J. H., Vander Meer, R. Red meat and colon cancer: the cytotoxic and hyperproliferative effects of dietary heme. Cancer Res. 59, 5704-5709 (1999).
- Fearon, E. R. Molecular genetics of colorectal cancer. Annu. Rev. Pathol. 6, 479-507 (2011).
- Nishisho, I., et al. Mutations of chromosome 5q21 genes in FAP and colorectal cancer patients. Science. 253, 665-669 (1991).
- Xue, X., et al. Hypoxia-inducible factor-2alpha activation promotes colorectal cancer progression by dysregulating iron homeostasis. Cancer Res. 72, 2285-2293 (2012).
- Liu, W., et al. Mutations in AXIN2 cause colorectal cancer with defective mismatch repair by activating beta-catenin/TCF signalling. Nat. Genet. 26, 146-147 (2000).
- Morin, P. J., et al. Activation of beta-catenin-Tcf signaling in colon cancer by mutations in beta-catenin or APC. Science. 275, 1787-1790 (1997).
- Brattain, M. G., Fine, W. D., Khaled, F. M., Thompson, J., Brattain, D. E. Heterogeneity of malignant cells from a human colonic carcinoma. Cancer Res. 41, 1751-1756 (1981).
- Leibovitz, A., et al. Classification of human colorectal adenocarcinoma cell lines. Cancer Res. 36, 4562-4569 (1976).
- Willson, J. K., Bittner, G. N., Oberley, T. D., Meisner, L. F., Weese, J. L. Cell culture of human colon adenomas and carcinomas. Cancer Res. 47, 2704-2713 (1987).
- Brattain, M. G., Strobel-Stevens, J., Fine, D., Webb, M., Sarrif, A. M. Establishment of mouse colonic carcinoma cell lines with different metastatic properties. Cancer Res. 40, 2142-2146 (1980).
- Ikubo, A., Aoki, Y., Nagai, E., Suzuki, T. Highly metastatic variant of a mouse colon carcinoma cell line, LM17 and its response to GM-CSF gene therapy. Clin. Exp. Metastasis. 17, 849-855 (1999).
- Basant, S. K., Rinesh, K. Principles Of Animal Cell Culture. Student Compendium. Textbook Student Edition. 6, 61-96 (2008).
- Vachon, P. H., et al. Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis. Gastroenterology. 123, 1980-1991 (2002).
- Darido, C., et al. Defective claudin-7 regulation by Tcf-4 and Sox-9 disrupts the polarity and increases the tumorigenicity of colorectal cancer cells. Cancer Res. 68, 4258-4268 (2008).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Yui, S., et al. Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5(+) stem cell. Nat. Med. 18, 618-623 (2012).
- Anderson, E. R., Xue, X., Shah, Y. M. Intestinal hypoxia-inducible factor-2alpha (HIF-2alpha) is critical for efficient erythropoiesis. J. Biol. Chem. 286, 19533-19540 (2011).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Kondo, J., et al. Retaining cell-cell contact enables preparation and culture of spheroids composed of pure primary cancer cells from colorectal cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 6235-6240 (2011).
- Clevers, H., Nusse, R. Wnt/beta-catenin signaling and disease. Cell. 149, 1192-1205 (2012).
