Un modèle de poisson zèbre du diabète sucré et de la mémoire métabolique

Summary

Mémoire métabolique est le phénomène par lequel les complications du diabète persistent et progresser sans entrave, même après euglycémie est atteint pharmaceutique. Nous décrivons ici un modèle de poisson zèbre diabète sucré qui est unique en ce qu'elle permet d'examiner des éléments mitotiquement transmissibles épigénétiques de mémoire métabolique<em> In vivo</em>.

Abstract

Le diabète sucré touche actuellement 346 millions personnes et ce nombre devrait passer à 400 millions en 2030. Preuve à la fois de laboratoire et de grands essais cliniques ont montré que les complications diabétiques progrès sans entrave par le phénomène de la mémoire métabolique, même si le contrôle glycémique est pharmaceutiquement atteint. L'expression des gènes peut être modifiée par des modifications de façon stable épigénétiques qui non seulement permettent aux cellules et aux organismes de répondre rapidement à l'évolution des stimuli de l'environnement, mais aussi conférer la capacité de la cellule à «mémoriser» ces rencontres une fois que le stimulus est enlevé. En tant que tel, les rôles que ces mécanismes jouent dans le phénomène de la mémoire métabolique sont actuellement à l'étude.

Nous avons récemment rapporté le développement d'un modèle de poisson zèbre de sucré de type I, diabète et caractérisé ce modèle pour montrer que le poisson-zèbre diabétique non seulement afficher les complications connues secondaires, y compris les changements liésla rétinopathie diabétique, la néphropathie diabétique et la guérison des plaies, mais présentent également une déficience de régénération de la nageoire caudale. Ce modèle est unique en ce que le poisson-zèbre est capable de régénérer son pancréas endommagé et restaurer un état euglycémique similaire à ce qui serait attendu en post-transplantation chez des patients humains. En outre, plusieurs séries d'amputation de la nageoire caudale permet la séparation et l'étude de purs effets épigénétiques dans un système in vivo sans potentiels facteurs de complication de l'état diabétique précédente. Bien que euglycémie est atteint après régénération du pancréas, la complication diabétique secondaire de la régénération des nageoires et cicatrisation de la peau persiste indéfiniment. Dans le cas de la régénération des nageoires avec facultés affaiblies, cette pathologie est conservé même après plusieurs cycles de régénération des nageoires dans les tissus ailettes fille. Ces observations indiquent un processus épigénétique sous-jacente existant dans l'état de la mémoire métabolique. Nous présentons ici les méthodes nécessaires à la réussite genlérer la mémoire des groupes diabétiques et métaboliques des poissons et de discuter des avantages de ce modèle.

Introduction

Le diabète sucré (DM) est un problème de santé grave et croissant que les résultats de l'espérance de vie réduite en raison de complications microvasculaires maladie spécifique (rétinopathie, néphropathie, neuropathie, la guérison des plaies) et macrovasculaires (cardiopathie et accident vasculaire cérébral) des complications ^1. Une fois lancés, les complications diabétiques continuer à progresser sans interruption, même lorsque le contrôle glycémique est obtenu ^2,3 et ce phénomène a été appelé mémoire métabolique ou l'effet de l'héritage. La présence de ce phénomène a été reconnu cliniquement début des années 1990 que le «Le Diabetes Control and Complications Trial (DCCT)« progressé depuis et a été soutenu par plusieurs autres études cliniques ^{4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14.} Les modèles animaux de DM ont joué un rôle crucial pour les découvertes liées à la physiopathologie de complications liées au diabète et à la mémoire métabolique. En effet, la persistance des complications du diabète a d'abord été documentés dans un modèle canin de diabèterétinopathie, qui a depuis été appuyé par plusieurs lignes de données expérimentales en utilisant une variété de systèmes de culture in vitro et des modèles animaux ^{15,16,17,18,19,20,21.} Ces études montrent clairement que les premiers résultats une période d'hyperglycémie dans les anomalies stables (y compris l'expression génique aberrante) des organes / cellules cibles et mécaniste suggère l'implication de l'épigénome.

Épigénomes compose de tous les modifications de la chromatine pour un type cellulaire donné et sont responsables de cellule unique d'un profil d'expression génique. Les modifications chromosomiques sont dynamiques au cours du développement, la différenciation des cellules de soutien, sont sensibles à des stimuli externes, sont mitotiquement stabilité héréditaire ^22,23 et peuvent être modifiées dans la maladie ^24,25,26. Ces mécanismes épigénétiques comprennent: poster traductionnelles des histones, modifications non canonique d'inclusion variant d'histone dans octomers, les changements d'accès grâce à la chromatine, méthylation de l'ADN et des gènescontrôle de l'expression par ARN non codants micro ^27,28,29,30. Au total, les processus épigénétiques permettent aux cellules / organismes de réagir rapidement à l'évolution des stimuli environnementaux ^31,32,33, ils confèrent également la capacité de la cellule à «mémoriser» ces rencontres une fois que le stimulus est enlevé ^23,22. Par conséquent, comme altérées profils d'expression génique résultant de processus épigénétiques sont stables en l'absence du signal (s) qui les a initiées et sont héréditaires par division cellulaire, ils ont acquis un grand intérêt en tant que sous-tendent les mécanismes moléculaires de pathologies humaines comme la mémoire métabolique. Les résultats qui émergent dans le contexte du DM et de l'épigénétique avancées parallèles dans d'autres maladies en ce qu'une pléthore de modifications épigénétiques induites par l'hyperglycémie provoquent remarquables changements persistants dans les réseaux transcriptionnels des cellules (revue en ^{34,35,36,37,38).}

Le poisson-zèbre a longtemps été un organisme modèle pour étudiants de premierdy vertébrés développement mais les 15 dernières années ont vu une croissance exponentielle dans l'utilisation de cet organisme pour l'étude des maladies humaines. ^39. Modèles de maladies humaines poisson zèbre ont été mis en place couvrant un large éventail de pathologies humaines, y compris les maladies génétiques et les maladies acquises ^40,41,42. Les nombreux avantages du poisson zèbre par rapport aux autres organismes modèles vertébrés comprennent une fécondité élevée, le temps de génération court, la transparence grâce à l'âge adulte, les coûts du logement réduit et une gamme d'outils pour la manipulation génétique. En outre, en raison de l'étendue de la conservation des voies génétiques et physiologie cellulaire chez les vertébrés et la capacité d'effectuer des dépistages de drogue débit élevé, le poisson zèbre a été utilisé avec succès pour la découverte pharmaceutique.

Nous avons développé un modèle de poisson zèbre adulte du diabète de type I en utilisant le médicament diabétogène, streptozocine. Nous avons caractérisé ce modèle pour montrer que le poisson-zèbre diabétique net n'afficher que les plus connus de l'homme de complications secondaires, mais en plus, présentent des troubles de la régénération des membres (régénération de la nageoire caudale) à la suite de l'environnement hyperglycémique. En outre, nous avons signalé que le poisson-zèbre hyperglycémique revenir à une glycémie normale dans les 2 semaines suivant le retrait du médicament en raison de la régénération des cellules bêta pancréatiques endogènes résultant dans un état glycémique physiologiquement normal. Toutefois, en revanche, la régénération des membres chez ces poissons reste compromise dans la même mesure que dans l'état diabétique aiguë indiquant cette complication persiste et est sensible à la mémoire métabolique. Le principal moteur de la génération de ce modèle est de fournir un système pour étudier les composantes mitotiquement stables épigénétiques qui prennent en charge le phénomène de la mémoire métabolique en l'absence du bruit de fond de l'environnement hyperglycémique précédente. À la conclusion du protocole prévu ici les tissus de poisson zèbre et ou sélectives peuvent être traitées par un essai approprié pour la recherrchers besoin. Nous avons utilisé avec succès cette procédure pour identifier les changements à l'échelle du génome persistantes dans méthylation de l'ADN induites par l'hyperglycémie qui sont maintenus dans l'état de la mémoire métabolique ^21.

Nous pensons que ce modèle de poisson zèbre de type I diabète présente plusieurs avantages par rapport aux systèmes innovants d'autres modèles pour l'examen de la mémoire métabolique. 1) Tous nos études peuvent être menées in vivo et que le poisson hyperglycémique précédent retour à une glycémie normale grâce à la régénération de la production d'insuline endogène, ils n'ont pas besoin d'injections d'insuline exogène. Par conséquent, ce qui évite les pics et les vallées de complication dans le contrôle glycémique qui peuvent survenir chez les animaux ayant besoin d'insuline exogène. 2) Comme décrit ci-dessus, la stimulation de fond de l'état diabétique précédente (à savoir la présence continue de glycation avancée des produits et réactifs marqueurs des espèces d'oxygène) sont éliminées et par conséquent on peut examiner l'aspect purement EPIGfacteurs enetic de mémoire métabolique. 3) Les expériences peuvent être réalisées rapidement que cela prend environ 80 jours à compter de l'induction du diabète jusqu'à l'examen mémoire métabolique. 4) la régénération caudale est expérimentalement très accessible et permet la manipulation génétique et expérimentale facile pour lesquels il existe une vaste gamme d'outils. 5) la régénération caudale fournit une méthode très simple et quantifiables pour évaluer la mémoire métabolique et donc permettra de découverte de médicaments avenir.

Protocol

Toutes les procédures sont exécutées suivant les directives décrites dans les «Principes de protection des animaux de laboratoire» (National Institutes of Health publication no. 85-23, révisée en 1985) et l'a approuvé Rosalind Franklin University soins aux animaux et l'utilisation des animaux Comité protocole de 08-19. Il ya 2 abréviations importantes qui sont utilisées dans ce manuscrit. 1) DM: se réfère aux poissons qui sont dans un état d'hyperglycémie (300 mg …

Representative Results

Type I zèbre diabétique non seulement afficher les complications connues secondaires de la rétinopathie et de la néphropathie, mais aussi, présentent une complication supplémentaire: altération de régénération de la nageoire caudale. Cette complication plus tard persiste en raison de la mémoire métabolique chez les poissons qui ont rétabli le contrôle du glucose normale après une période d'hyperglycémie. Dans la figure 2A (contrôle) et la figure 2B (mémoire métab…

Discussion

Le diabète sucré est une maladie de la dysrégulation métabolique, initialement diagnostiquée comme l'hyperglycémie, qui aboutit finalement à des dommages des vaisseaux sanguins conduisant à de nombreuses complications qui persistent même après tout euglycémie est atteint si l'intervention pharmaceutique. Cette persistance de complications est appelée mémoire métabolique et plusieurs études récentes ont examiné le rôle que jouent les mécanismes épigénétiques dans ce phénomène. Ici, nous av…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Streptozocin	Sigma Aldrich	S0130
2 phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
Scalpel (size 10)	Fisher Scientific	089275A
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
½ cc syringe, with 27 1/2 gauge needle	Fisher Scientific	305620
QuantiChrome glucose assay kit.	Bioassay Systems	DIGL-100
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
Image J software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.