En zebrafisk Model af diabetes mellitus og Metabolic Memory

Summary

Metabolic hukommelse er det fænomen, som diabetiske komplikationer fortsætter og fremskridt uhindret, selv efter euglykæmi opnås farmaceutisk. Her beskriver vi en diabetes mellitus zebrafisk model, som er enestående, fordi det giver mulighed for undersøgelse af de mitotisk overførbare epigenetiske komponenter af metabolisk hukommelse<em> In vivo</em>.

Abstract

Diabetes mellitus øjeblikket påvirker 346 millioner individer, og dette forventes at stige til 400 millioner i 2030. Beviser fra både laboratoriet og store kliniske undersøgelser har afsløret, at diabetiske komplikationer fremskridt uhindret via fænomenet metabolisk hukommelsen, selv når glykæmisk kontrol er farmaceutisk opnås. Genekspression kan stabilt ændres gennem epigenetiske ændringer, som ikke kun tillader celler og organismer til hurtigt at reagere på ændrede miljømæssige stimuli, men også bibringe evnen af ​​cellen til at "huske" disse møder, når stimulus er fjernet. Som sådan er de roller, disse mekanismer spiller i den metaboliske hukommelse fænomen øjeblikket undersøges.

Vi har for nylig rapporteret om udviklingen af ​​et zebrafisk model af type I diabetes mellitus og karakteriseres denne model til at vise, at diabetisk zebrafisk ikke kun vise de kendte sekundære komplikationer, herunder de associerede ændringermed diabetisk retinopati, diabetisk nefropati og nedsat sårheling, men også udviser nedsat halefinne regenerering. Denne model er unik ved, at zebrafisk er i stand til at regenerere sin beskadigede bugspytkirtel og genoprette en euglykæmisk tilstand svarer til, hvad man kunne forvente hos post-transplantations menneskelige patienter. Desuden flere runder af halefinnen amputation muligt at udskille og undersøgelse af rene epigenetiske virkninger i et in vivo system uden potentielle komplicerende faktorer fra det foregående diabetisk tilstand. Selv euglykæmi opnås efter pankreatisk regenerering, den diabetiske sekundære komplikation ved fin regenerering og huden sårheling fortsætter uendeligt. I tilfælde af nedsat fin regenerering, er denne patologi bevares, selv efter flere runder af fin regenerering i datterdirektiverne finne væv. Disse observationer peger på en underliggende epigenetisk proces findes i den metaboliske hukommelse tilstand. Her præsenterer vi de nødvendige metoder for at kunne generate de diabetiske og metaboliske hukommelse grupper af fisk og diskutere fordelene ved denne model.

Introduction

Diabetes mellitus (DM) er et alvorligt og voksende sundhedsproblem, som resulterer i nedsat levetid på grund af sygdom specifik mikrovaskulære (retinopati, nefropati, neuropati, nedsat sårheling) og makrovaskulære (hjertesygdomme og slagtilfælde) komplikationer ^1. Når først, diabetiske komplikationer fortsat at gøre uafbrudt, selv når glykæmisk kontrol opnås ^2,3, og dette fænomen er blevet betegnet metabolisk hukommelse eller arven virkning. Tilstedeværelsen af dette fænomen blev anerkendt klinisk i begyndelsen af 1990'erne som "The Diabetes Control and Complications Trial (DCCT)" skred frem, og siden er blevet støttet af flere yderligere kliniske forsøg ^{4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14.} Dyremodeller af DM har været afgørende for opdagelser relateret til patofysiologi af diabetiske komplikationer og metaboliske hukommelse. Faktisk blev de vedvarende diabetiske komplikationer første gang dokumenteret i en hundemodel af diabetiskeretinopati som siden er blevet støttet af flere linjer af eksperimentelle beviser ved hjælp af en række forskellige in vitro dyrkningssystemer og dyremodeller ^{15,16,17,18,19,20,21.} Disse undersøgelser viser klart, at en første hyperglykæmiske periode resulterer i permanente abnormiteter (herunder afvigende genekspression) af målorganer / celler, og mekanistisk foreslår inddragelse af epigenome.

Epigenomes omfatte alle de chromatin modifikationer for en given celletype og er ansvarlige for en celle unikke genekspression profil. Kromosomet modifikationer er dynamiske under udvikling, support celledifferentiering, der reagerer på eksterne stimuli, er mitotisk nedarves stabilt ^22,23 og kan ændres i sygdommen ^24,25,26. Disse epigenetiske mekanismer omfatter: posttranslationelle histon modifikationer, ikke-kanonisk histon variant medtagelse i octomers, kromatin adgang ændringer gennem DNA-methylering, og gen-udtryk kontrol gennem ikke-kodende mikro RNA'er ^27,28,29,30. Alt i alt epigenetiske processer tillade celler / organismer til hurtigt at reagere på skiftende miljømæssige stimuli ^31,32,33, de også giver mulighed for at cellen kan "huske" disse møder, når stimulus er fjernet ^23,22. Derfor som ændret genekspression profiler som følge af epigenetiske fremgangsmåder er stabile i fravær af signalet (e), der indledte dem og arvelige gennem celledeling, har de vundet stor interesse som underliggende molekylære mekanismer for humane patologier, herunder metabolisk hukommelse. De resultater, der dukker op i forbindelse med DM og epigenetik parallelle fremskridt på andre sygdomme, at en overflod af epigenetiske forandringer som følge af hyperglykæmi forårsager bemærkelsesværdige vedvarende ændringer i transkriptionelle netværk af celler (revideret i ^{34,35,36,37,38).}

Det zebrafisk har længe været en premier model organisme til studerendedy hvirveldyr udvikling dog de ​​sidste 15 år har oplevet en eksponentiel vækst i anvendelse af denne organisme til studiet af sygdom hos mennesker. ^39. Zebrafisk modeller af human sygdom er blevet fastlagt spænder over et bredt spektrum af humane sygdomme, herunder genetiske sygdomme og erhvervede sygdomme ^40,41,42. De mange fordele ved zebrafisk over andre hvirveldyr modelorganismer omfatter høj frugtbarhed, korte generationstid, gennemsigtighed gennem den tidlige voksenalder, reducerede boligudgifter og en vifte af værktøjer til genmanipulation. Som følge af den omfattende bevaring af genetiske veje og cellulær fysiologi blandt hvirveldyr og evnen til at udføre high throughput lægemiddel-screening, er zebrafisk succes været anvendt til farmaceutiske opdagelser.

Vi har udviklet en voksen zebrafisk model af type I diabetes mellitus ved hjælp af diabetogene stof, streptozocin. Vi har karakteriseret denne model at vise, at diabetisk zebrafisk ikket kun vise de kendte humane sekundære komplikationer, men derudover svækkede lem regenerering (halefinne regenerering) udviser som følge af hyperglykæmisk miljø. Desuden har vi rapporteret, at hyperglykæmisk zebrafisk vende tilbage til normal glycemia inden for 2 uger fjerne lægemidlet på grund regenerering af endogene bugspytkirtlens betaceller resulterer i en fysiologisk normal glykæmisk tilstand. I modsætning, forbliver led regenerering i disse fisk nedsat i samme grad som i den akutte diabetiske tilstand angiver denne komplikation fortsætter og er modtagelige for metabolisk hukommelse. Den væsentligste drivkraft til generering af denne model var at tilvejebringe et system til at studere mitotisk stabile epigenetiske komponenter, der understøtter den metaboliske hukommelse fænomen i fravær af baggrundsstøjen i det foregående hyperglykæmiske miljø. Ved afslutningen af ​​protokollen i henhold her de zebrafisk og eller selektive væv kan behandles ved enhver analyse er egnet til researchers behov. Har vi med succes anvendt denne fremgangsmåde til at identificere de genom-dækkende vedvarende ændringer i DNA-methylering induceret af hyperglykæmi, der vedligeholdes i den metaboliske lagertilstand ^21.

Vi føler, at dette zebrafisk model af type I diabetes mellitus har flere innovative fordele frem for andre modelsystemer for at undersøge metabolisk hukommelse. 1) Alle vores undersøgelser kan udføres in vivo, og som det tidligere hyperglykæmiske fiskene tilbage til euglykæmi ved regenerering af endogen insulinproduktion, kræver de ikke exogene insulininjektioner. Derfor er dette undgår komplicerende spidser og dale i glykæmisk kontrol, der kan forekomme i dyr, der kræver eksogen insulin. 2) Som beskrevet ovenfor er baggrunden stimulation fra det foregående diabetisk tilstand (dvs. den fortsatte tilstedeværelse af fremskreden glycosylering-slutprodukter og reaktive oxygenarter markører) elimineret, og derfor kan man undersøge rent epigenetic faktorer metabolisk hukommelse. 3) Forsøgene kan udføres hurtigt, som det tager cirka 80 dage fra diabetes induktion, indtil metabolisk memory undersøgelse. 4) halefinnen regenerering er eksperimentelt meget tilgængelig og giver mulighed for nem genetisk og eksperimenterende manipulation, hvor der er en bred vifte af værktøjer. 5) halefinnen regenerering giver en meget enkel og kvantificerbar metode til vurdering af metabolisk hukommelse og derfor vil muliggøre fremtidig lægemiddelopdagelse.

Protocol

Alle procedurer udføres efter de retningslinjer, der er beskrevet i "Principles of Laboratory Animal Care" (National Institutes of Health publikation no. 85-23, revideret 1985) og den godkendte Rosalind Franklin University Institutional Animal Care og brug Udvalg dyr protokol 08-19. Der er to vigtige forkortelser, der anvendes i dette håndskrift. 1) DM: refererer til fisk, der er i en akut (300 mg / dl) hyperglykæmisk tilstand og har været det i mindst 3 uger. 2) MM: refererer …

Representative Results

Type I diabetisk zebrafisk ikke kun vise de kendte sekundære komplikationer af retinopati og nefropati, men også udviser en yderligere komplikation: nedsat halefinne regenerering. Denne senere komplikation fortsætter skyldes metabolisk hukommelse i fisk, der har gendannet normal blodsukkerregulering efter en hyperglykæmisk periode. I figur 2A (kontrol) og Figur 2B (metabolisk hukommelse) repræsentative billeder af regenererende finner, der blev fanget ved 72 timer efter amputation …

Discussion

Diabetes mellitus er en sygdom i metabolisk dysregulation, først diagnosticeret som hyperglykæmi, der til sidst resulterer i beskadigelse af blodkar, der fører til mange komplikationer som alle fortsætter selv efter euglykæmi opnås selvom farmaceutisk intervention. Denne vedvarende komplikationer kaldes metabolisk hukommelse og flere nylige studier har undersøgt den rolle, epigenetiske mekanismer spille på dette fænomen. Her har vi beskrevet en protokol, der giver mulighed for generering af både akut diabetisk…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Streptozocin	Sigma Aldrich	S0130
2 phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
Scalpel (size 10)	Fisher Scientific	089275A
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
½ cc syringe, with 27 1/2 gauge needle	Fisher Scientific	305620
QuantiChrome glucose assay kit.	Bioassay Systems	DIGL-100
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
Image J software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.