Ein Zebrafisch Modell des Diabetes mellitus und Stoffwechselkrankheiten Speicher

Summary

Metabolic Speicher ist das Phänomen, mit dem diabetischen Komplikationen fortbestehen und Fortschritte ungehinderten auch nach euglycemia pharmazeutisch erreicht. Hier beschreiben wir eine Diabetes mellitus Zebrafisch Modell, das einzigartig ist, dass es ermöglicht die Prüfung der mitotisch übertragbare epigenetische Komponenten des metabolischen Speicher<em> In vivo</em>.

Abstract

Diabetes mellitus betrifft derzeit 346 Millionen Menschen und wird dies voraussichtlich auf 400 Millionen im Jahr 2030 erhöhen. Evidence from Labor und großangelegte klinische Studien haben gezeigt, dass diabetische Komplikationen Fortschritt über das Phänomen des metabolischen Speicher, selbst wenn die glykämische Kontrolle pharmazeutisch erreicht ungehindert. Genexpression kann stabil durch epigenetischen Veränderungen, die nicht nur ermöglichen Zellen und Organismen, schnell auf sich ändernde Umweltbedingungen Reize reagieren verändert werden, sondern auch die Fähigkeit verleihen der Zelle auf "auswendig" diese stößt, sobald die Impulse entfernt wird. Als solche sind die Rollen, die diese Mechanismen spielen im Stoffwechsel Gedächtnisphänomen derzeit geprüft.

Wir haben vor kurzem die Entwicklung eines Zebrafisch-Modell vom Typ-I-Diabetes mellitus berichtet und charakterisiert dieses Modell, dass diabetische Zebrafisch zeigen, zeigen nicht nur die bekannten Folgeerkrankungen einschließlich der Veränderungen verbundenmit diabetischer Retinopathie, diabetischer Nephropathie und Wundheilungsstörungen sondern weisen auch beeinträchtigt Schwanzflosse Regeneration. Dieses Modell ist einzigartig, da die Zebrafisch ist in der Lage, ihre beschädigten Bauchspeicheldrüse zu regenerieren und wieder einen euglykämische Zustand ähnlich zu dem, was nach der Transplantation menschlicher Patienten erwartet werden. Außerdem mehrere Runden der Schwanzflosse Amputation zur Trennung und Untersuchung von reinem epigenetische Effekte de einem in vivo System ohne potentiellen Komplikationsfaktoren vom vorherigen diabetischen Zustand erlauben. Obwohl euglycemia nach Pankreas-Regeneration erreicht wird, bleibt der diabetischen sekundäre Komplikation fin Regeneration und Haut Wundheilung auf unbestimmte Zeit. Im Fall der gestörte Flosse Regenerierung wird diese Pathologie auch nach mehreren Runden der Flosse Regeneration in den Tochterzellen Flosse Gewebe zurückgehalten. Diese Beobachtungen deuten auf eine zugrunde liegende epigenetischer Prozess bestehenden in der metabolischen Speicher Zustand. Hier präsentieren wir Ihnen die Methoden benötigt, um erfolgreich generate die Diabetiker und metabolischen Speicher Gruppen von Fischen und diskutieren die Vorteile dieses Modells.

Introduction

Diabetes mellitus (DM) ist ein ernstes und zunehmendes gesundheitliches Problem, dass zu einer verringerten Lebenserwartung durch krankheitsspezifische mikrovaskulären (Retinopathie, Nephropathie, Neuropathie, Wundheilungsstörungen) und makrovaskuläre (Herzerkrankungen und Schlaganfall) Komplikationen ^1. Einmal ausgelöst, diabetischen Komplikationen weiterhin Fortschritte ununterbrochenen selbst wenn Blutzuckerkontrolle ^2,3 erreicht wird und dieses Phänomen wurde metabolischen Speicher oder den Legacy-Effekt bezeichnet. Das Vorhandensein dieses Phänomen wurde klinisch in den frühen 1990er Jahren als "The Diabetes Control and Complications Trial (DCCT)" Fortschritte gemacht und hat seit durch mehrere zusätzliche klinische Studien ^{4,5,6,7,8,9,10} unterstützt ^{erkannt, 11,12,13,14.} Tiermodelle der DM wurden entscheidend für Entdeckungen im Zusammenhang mit der Pathophysiologie der diabetischen Komplikationen und Stoffwechselkrankheiten Speicher. In der Tat war die Persistenz von diabetischen Komplikationen zunächst in einem Hundemodell der diabetischen dokumentiertRetinopathie welche inzwischen von mehreren Linien der experimentelle Nachweis unter Verwendung einer Vielzahl von in-vitro-Kultur-Systeme und Tiermodellen ^{15,16,17,18,19,20,21} unterstützt. Diese Studien zeigen deutlich, dass eine anfängliche hyperglycemic Zeitraum führt zu einer dauerhaften Anomalien (einschließlich aberrante Genexpression) von Zielorganen / Zellen und mechanistisch das Engagement des Epigenom schlägt.

Epigenome bestehen aus allen Chromatinmodifikationen für einen gegebenen Zelltyp und sind verantwortlich für eine Zelle einzigartigen Genexpressionsprofils. Die Chromosomen-Modifikationen sind während der Entwicklung, Unterstützung Zelldifferenzierung dynamisch reagieren auf äußere Reize sind mitotisch stabil vererbt und ^22,23 kann in Krankheit ^24,25,26 verändert werden. Diese epigenetischen Mechanismen beinhalten: posttranslationalen Histon-Modifikationen, nicht-kanonischen Histon-Variante Aufnahme in octomers, Chromatin Zugang Veränderungen durch DNA-Methylierung und GenAusdruck Kontrolle durch nicht-kodierende micro RNAs ^27,28,29,30. Insgesamt epigenetische Prozesse Zellen / Organismen sich schnell an verändernde Reize aus der Umwelt ^31,32,33 reagieren können, sondern auch die Fähigkeit verleihen der Zelle zu "merken" diese Begegnungen, sobald der Reiz ^23,22 entfernt. Daher wird, wie veränderter Genexpression, die aus Profilen epigenetische Prozesse in Abwesenheit des Signals (s), die sie initiiert sind stabil und werden durch Zellteilung vererbbare, haben sie große Interesse als Basiswert molekularen Mechanismen von menschlichen Erkrankungen einschließlich metabolischen Speichers gewonnen. Die Ergebnisse, die im Kontext von DM und Epigenetik parallel Fortschritte bei anderen Erkrankungen, dass eine Fülle von epigenetischen Veränderungen durch Hyperglykämie induziert verursachen bemerkenswerte Änderungen in persistente Transkriptionsnetzwerke von Zellen (besprochen in ^{34,35,36,37,38)} abzeichnen.

Der Zebrafisch ist seit langem ein führender Modellorganismus zur study Entwicklung von Wirbeltieren jedoch in den letzten 15 Jahren ein exponentielles Wachstum bei der Nutzung dieses Organismus für das Studium der menschlichen Krankheit. ³⁹ gesehen. Zebrafisch Modellen menschlicher Erkrankungen wurden eingerichtet überspannt eine Vielzahl menschlicher Erkrankungen einschließlich genetischer Erkrankungen und erworbenen Krankheit ^40,41,42. Die vielen Vorteile des Zebrafisch gegenüber anderen Wirbeltieren Modell-Organismen sind die hohe Fruchtbarkeit, kurze Generationszeit, Transparenz durch frühen Erwachsenenalter verringert Wohnkosten und eine Reihe von Werkzeugen für die Gen-Manipulation. Darüber hinaus wurden aufgrund der umfangreichen Erhaltung der genetischen Signalwege und zellulären Physiologie unter den Wirbeltieren und die Fähigkeit, einen hohen Durchsatz Drogen-Screenings durchzuführen, hat der Zebrafisch erfolgreich für pharmazeutische Entdeckung verwendet.

Wir haben einen Erwachsenen Zebrafischmodell von Typ I-Diabetes mellitus, welche die diabetogene Droge, Streptozocin entwickelt. Wir haben dieses Modell gekennzeichnet zu zeigen, dass diabetische Zebrafisch nichtt zeigt nur die bekannten menschlichen sekundären Komplikationen, sondern darüber hinaus zeigen beeinträchtigten Extremität Regeneration (Schwanzflosse Regeneration) als Folge der Hyperglykämie Umwelt. Darüber hinaus haben wir berichtet, dass hyperglykämischen Zebrafisch wieder zurück zu normalen Glykämie innerhalb von 2 Wochen Medikament Entfernung aufgrund Regeneration von endogenen Betazellen des Pankreas, was zu einem physiologisch normalen glykämischen Zustand. Jedoch im Gegensatz dazu bleibt Schenkel Regeneration in dieser Fische beeinträchtigt im gleichen Umfang wie in der akuten diabetischen Zustand anzeigt, diese Komplikation auftritt und ist anfällig für metabolische Speicher. Die wichtigsten Impulse für die Erzeugung dieses Modells war es, ein System, um die mitotisch stabile epigenetische Komponenten, die den Stoffwechsel Gedächtnisphänomen unterstützt in der Abwesenheit von dem Hintergrundrauschen des vorherigen hyperglycemic Umgebung zu studieren bieten. Am Abschluß des Protokolls bereitgestellt hier die Zebrafisch oder selektive und Geweben, die durch jeden Assay geeignet ist, der verarbeitet werden kann Forschurchers braucht. Wir haben erfolgreich dieses Verfahren verwendet, um die genomweite anhaltenden Veränderungen in der DNA-Methylierung durch Hyperglykämie induziert, die im Stoffwechsel Speicherzustand ²¹ beibehalten werden zu identifizieren.

Wir glauben, dass diese Zebrafisch Modell vom Typ-I-Diabetes mellitus mehrere innovative Vorteile gegenüber anderen Modellsystemen für die Prüfung metabolische Gedächtnis hat. 1) Alle unsere Studien in vivo durchgeführt werden und wie das vorherige hyperglycemic Fisch euglycemia zurück durch Regeneration der endogenen Produktion von Insulin, sie benötigen keine exogenen Insulin-Injektionen. Daher vermeidet dies die kompliziert Spitzen und Täler der glykämischen Kontrolle in Tiere, die exogenen Insulins auftreten können. 2) Wie oben, der Hintergrund Stimulation aus der früheren diabetischen Zustand (dh die ständige Präsenz von fortgeschrittener Glykosylierung Endprodukte und reaktiven Sauerstoffspezies-Marker) werden eliminiert beschrieben und deshalb kann man die rein EPIG untersuchenenetic Faktoren des metabolischen Speicher. 3) Die Experimente können schneller durchgeführt werden, da es rund 80 Tage an Diabetes Induktion dauert, bis metabolischen Speicher Untersuchung. 4) Schwanzflosse Regeneration ist experimentell sehr zugänglich und ermöglicht eine einfache genetische und experimentelle Manipulation, für die gibt es eine Vielzahl von Werkzeugen. 5) Schwanzflosse Regeneration bietet eine sehr einfache und quantifizierbare Methode zur metabolischen Speicher beurteilen und daher für zukünftige Wirkstoffentwicklung ermöglichen.

Protocol

Alle Vorgänge werden nach den Richtlinien in "Principles of Laboratory Animal Care" beschrieben (National Institutes of Health Veröffentlichungs-Nr. 85-23, revidiert 1985) und der zugelassenen Rosalind Franklin University Institutional Animal Care durchgeführt und Verwenden Ausschuss Tier-Protokoll 08-19. Es gibt 2 wichtige Abkürzungen, die in diesem Manuskript verwendet werden. 1) DM: bezieht sich auf Fische, die in einer akuten (300 mg / dl) hyperglycemic Zustand sind und fü…

Representative Results

Typ I Diabetes Zebrafisch zeigen nicht nur die bekannten sekundären Komplikationen der Retinopathie und Nephropathie, aber auch, weisen eine zusätzliche Komplikation: eingeschränkter Schwanzflosse Regeneration. Diese späteren Komplikation besteht aufgrund metabolischer Speicher in Fische, die normale Blutzuckereinstellung restauriert wurden nach einer hyperglycemic Zeitraum. In 2A (Kontrolle) und 2B (metabolische Speicher) repräsentative Bilder der Regeneration Flossen, die bei 72 …

Discussion

Diabetes mellitus ist eine Erkrankung des metabolischen Dysregulation, zunächst als Hyperglykämie, die letztlich ergibt Blutgefäß beschädigt, was zu vielen Komplikationen, die alle auch bestehen, nachdem euglycemia obwohl pharmazeutische Intervention erreicht wird diagnostiziert. Diese Persistenz von Komplikationen wird als metabolische Speicher und mehrere aktuelle Studien haben die Rolle, dass epigenetische Mechanismen spielen bei diesem Phänomen untersucht bezeichnet. Hier haben wir ein Protokoll, das für die …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Streptozocin	Sigma Aldrich	S0130
2 phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
Scalpel (size 10)	Fisher Scientific	089275A
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
½ cc syringe, with 27 1/2 gauge needle	Fisher Scientific	305620
QuantiChrome glucose assay kit.	Bioassay Systems	DIGL-100
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
Image J software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.