En Zebrafish modell av diabetes mellitus och metabola Memory

Summary

Metabolisk minne är det fenomen genom vilket diabeteskomplikationer kvarstår och utvecklas obehindrat även efter euglykemi uppnås farmaceutiskt. Här beskriver vi en diabetes mellitus zebrafisk modell som är unik genom att den möjliggör granskning av de mitotiskt överförbara epigenetiska komponenter i metabolisk minne<em> In vivo</em>.

Abstract

Diabetes mellitus drabbar idag 346 miljoner människor och detta förväntas öka till 400 miljoner år 2030. Bevis från både laboratorie-och storskaliga kliniska prövningar har visat att diabeteskomplikationer framsteg obehindrat genom fenomenet metabola minnet även när glykemisk kontroll farmaceutiskt uppnås. Genuttryck kan stabilt förändras genom epigenetiska förändringar som inte bara tillåter celler och organismer att snabbt reagera på förändrade miljön stimuli, utan också ger möjlighet för cellen att "memorera" dessa möten när stimulansen avlägsnats. Som sådana är de roller som dessa mekanismer spelar i den metaboliska minnet fenomenet närvarande granskas.

Vi har nyligen rapporterat att utveckla en zebrafisk modell typ I diabetes mellitus och kännetecknas denna modell för att visa att diabetiker zebrafisk inte bara visa de kända sekundära komplikationer inklusive tillhörande ändringarmed diabetesretinopati, diabetesnefropati och försämrad sårläkning, men också uppvisar nedsatt stjärtfenan förnyelse. Denna modell är unik i att zebrafisk är kapabel att regenerera dess skadade bukspottkörteln och återställa ett euglykemiska tillstånd som liknar vad som skulle förväntas i efter transplantation humanpatienter. Dessutom, flera omgångar av stjärtfenan amputering möjliggöra separation och studiet av rena epigenetiska effekter i ett in vivo-system utan potentiella komplicerande faktorer från föregående diabetiska tillståndet. Även euglykemi uppnås efter pankreas förnyelse, kvarstår den diabetiska sekundära komplikation av fin förnyelse och hud sårläkning obestämd tid. I fallet med nedsatt fin förnyelse, detta patologi kvar även efter flera omgångar av fin förnyelse i vävnaderna dotter fin. Dessa observationer pekar på en underliggande epigenetisk process som finns i den metaboliska minnet staten. Här presenterar vi de metoder som krävs för att framgångsrikt gendande av diabetes och metabola minne grupper av fisk och diskutera fördelarna med denna modell.

Introduction

Diabetes mellitus (DM) är ett allvarligt och växande hälsoproblem som leder till minskad medellivslängd på grund av sjukdom specifik mikrovaskulära (retinopati, nefropati, neuropati, försämrad sårläkning) och makrovaskulär (hjärtsjukdomar och stroke) komplikationer ^1. När initierats diabeteskomplikationer fortsätta att utvecklas utan avbrott även när glykemisk kontroll uppnås ^2,3 och detta fenomen har benämnts metabolisk minne eller äldre effekten. Förekomsten av detta fenomen erkändes kliniskt under tidigt 1990-tal som "Diabetes Control and Complications Trial (DCCT)" utvecklats och sedan har fått stöd av flera ytterligare kliniska prövningar ^{4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14.} Djurmodeller för DM har varit kritiska för upptäckter relaterade till pato-fysiologi diabeteskomplikationer och metabolisk minne. I själva verket var ihållande diabeteskomplikationer första dokumenterade i en hundmodell av diabetesretinopati som sedan fått stöd av flera rader av experimentella bevis med hjälp av olika in vitro kultur system och djurmodeller ^{15,16,17,18,19,20,21.} Dessa studier visar tydligt att en första hyperglykemiska period resulterar i permanenta avvikelser (inklusive avvikande genuttryck) av målorgan / celler och mekanistiskt föreslår engagemang epigenomet.

Epigenomes består av alla de kromatin ändringar för en viss celltyp och ansvarar för en cell unika genuttryck profil. Kromosomen ändringar är dynamiska under utvecklingen, stöd celldifferentiering, är lyhörda för yttre stimuli, är mitotiskt stabilt ärvda ^22,23 och kan ändras i sjukdom ^24,25,26. Dessa epigenetiska mekanismer är: posttranslationell histon modifieringar, icke-kanoniska histon varianten integration i octomers, kromatin förändringar tillgång genom DNA-metylering och genuttryck kontroll genom icke-kodande mikro RNA ^27,28,29,30. Sammantaget epigenetiska processer tillåter celler / organismer att snabbt reagera på förändrade miljön stimuli ^31,32,33, ger de också möjlighet för cellen att "memorera" dessa möten när stimulansen avlägsnats ^23,22. Därför, eftersom förändrade genuttryck profiler till följd av epigenetiska processer är stabila i frånvaro av signalen (er) som initierade dem och ärftlig genom celldelning, har de vunnit stort intresse som underliggande molekylära mekanismer för mänskliga sjukdomar, inklusive metabolisk minne. De resultat som växer fram i samband med DM och epigenetik parallella framsteg i andra sjukdomar genom att en uppsjö av epigenetiska förändringar inducerade av hyperglykemi orsakar anmärkningsvärda ihållande förändringar i transkriptions nätverk av celler (granskas ^{34,35,36,37,38).}

Zebrafisk har länge varit en ledande modell organism till study ryggradsdjur utveckling men de senaste 15 åren har sett en exponentiell tillväxt i utnyttja denna organism för studier av sjukdomar hos människor. ^39. Zebrafisk modeller av mänsklig sjukdom har fastställts spänner över ett brett spektrum av mänskliga sjukdomar, inklusive genetiska sjukdomar och förvärvad sjukdom ^40,41,42. De många fördelarna med zebrafisk över andra organismer ryggradsdjur modell inkluderar hög fruktsamhet, kort generationstid, öppenheten genom tidig vuxen ålder, minskade kostnader bostäder och en mängd verktyg för genmanipulation. Dessutom, på grund av den omfattande bevarande av genetiska vägar och cellulär fysiologi bland ryggradsdjur och kapacitet att utföra stora visningar genomströmning läkemedel har zebrafisk framgångsrikt använts för läkemedelsforskning.

Vi har utvecklat en vuxen zebrafisk modell av typ I diabetes mellitus och med den diabetogena drogen, streptozocin. Vi har karakteriserat denna modell för att visa att diabetiker zebrafisk intet visa bara de kända humana sekundära komplikationer men dessutom uppvisar nedsatt lem regenerering (stjärtfenan regenerering) som en följd av hyperglykemiska miljön. Dessutom har vi rapporterat att hyperglykemiska zebrafisk återgår till normal glykemi inom 2 veckor av läkemedel bort på grund av förnyelse av endogena betacellerna vilket resulterar i en fysiologiskt normal glukoskontroll tillstånd. Men däremot är lem förnyelse i dessa fiskar försämras i samma utsträckning som i den akuta diabetiska tillståndet anger denna komplikation kvarstår och är mottaglig för metabolisk minne. Den huvudsakliga drivkraften för att generera denna modell var att skapa ett system för att studera mitotiskt stabila epigenetiska komponenter som stödjer det metabola minnet fenomenet i frånvaro av bakgrundsbrus tidigare hyperglykemiska miljön. Vid slutet av det protokoll som avses här de zebrafisk och eller selektiva vävnader kan bearbetas av någon analys är lämplig för forsknrchers behöver. Vi har framgångsrikt använt detta förfarande för att identifiera de genomet hela ihållande förändringar i DNA-metylering som induceras av hyperglykemi som hålls i den metaboliska minnet tillståndet ^21.

Vi anser att detta zebrafisk modell av typ I diabetes mellitus har flera innovativa fördelar jämfört med andra modellsystem för att undersöka metabolisk minne. 1) Alla våra studier kan utföras in vivo och som tidigare hyperglykemiska fisken tillbaka till euglykemi genom regenerering av endogen insulinproduktion de inte kräver exogena insulininjektioner. Därför undviker detta de komplicerande spikar och dalar i glykemisk kontroll som kan förekomma i djur som kräver exogent insulin. 2) Som beskrivits ovan är bakgrunden stimulans från föregående diabetiska tillståndet (dvs. den fortsatta närvaron av avancerade glykation slutprodukter och reaktiva syre markörer arter) elimineras och därmed kan man undersöka rent epigenetic faktorer metabolisk minne. 3) Försöken kan utföras snabbt eftersom det tar ca 80 dagar från diabetes induktion tills metabolisk minne undersökning. 4) Stjärtfena regenerering är experimentellt mycket trevligt ut och gör det lätt att genetisk och experimentell manipulation för vilka det finns ett brett utbud av verktyg. 5) Stjärtfena regenerering ger en mycket enkel och kvantifierbar metod för att bedöma den metaboliska minne och därför kommer att möjliggöra framtida läkemedelsutveckling.

Protocol

Alla procedurer utförs enligt de riktlinjer som beskrivs i "Principles of Laboratory Animal Care" (National Institutes of Health publikation nr. 85-23, reviderad 1985) och den godkända Rosalind Franklin University Institutional Animal Care och användning kommittén djur protokoll 08-19. Det finns 2 viktiga förkortningar som används i detta manuskript. 1) DM: hänvisar till fisk som befinner sig i ett akut (300 mg / dl) hyperglykemiska tillstånd och har varit i minst 3 veckor….

Representative Results

Typ I diabetes zebrafisk inte bara visar de kända sekundära komplikationer av retinopati och nefropati, men också uppvisar en ytterligare komplikation: försämrad stjärtfenan förnyelse. Denna senare komplikation kvarstår på grund av metabolisk minne i fisk som har återställt normal blodsockerkontroll efter en hyperglykemisk period. I figur 2A (kontroll) och figur 2B (metabolisk minne) representativa bilder av regenererande fenor som fångades vid 72 h efter amputation presente…

Discussion

Diabetes mellitus är en sjukdom av metabolisk dysreglering, ursprungligen diagnosen hyperglykemi, som slutligen resulterar i blodkärlsskada leder till många komplikationer som alla kvarstår även efter euglykemi uppnås dock farmaceutisk intervention. Denna ihållande komplikationer kallas metabolisk minne och flera färska studier har undersökt den roll som epigenetiska mekanismer spelar i detta fenomen. Här har vi detaljerad protokoll som gör det möjligt för generering av både akut diabetes och metabola minn…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Streptozocin	Sigma Aldrich	S0130
2 phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
Scalpel (size 10)	Fisher Scientific	089275A
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
½ cc syringe, with 27 1/2 gauge needle	Fisher Scientific	305620
QuantiChrome glucose assay kit.	Bioassay Systems	DIGL-100
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
Image J software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.