Kan ve Kültür Medya türetilen Exosomes saflaştırılması ve microRNA Profil
Summary
Exosomes istikrarlı microRNA (miRNA'lar) varlığı biyolojik olarak ve terapötik müdahale için bir yol olarak potansiyel programı için, hücreler arası iletişim yeni bir mod olarak büyük ilgi üretti. Burada taşınmaları miRNAs tespit etmek kantitatif PCR tarafından takip edilir ve kan kültür ortamından saflaştırılması exosome göstermektedir.
Abstract
Kararlı miRNA'lar tüm vücut sıvılarında bulunan ve bazı dolaşan miRNA'lar exosomes adı verilen küçük kesecikler içinde haciz tarafından bozulması korunur. Exosomes hedef hücre RNA ve protein aktarımı ile sonuçlanan plazma zarı ile birleştirebilirler. Onların biyolojik fonksiyonları immün yanıt, antijen sunumu, ve hücre içi iletişim içerir. Kan yoluyla alıcı hücrelerde gen ifadesini düzenler miRNA'lar teslimi hedef müdahale için yeni yollar açtı. Ilaç veya RNA terapötik ajanların teslimat için bir strateji sunan ek olarak, exosomal içeriği tedavi seçenekleri ve prognoz belirlenmesinde, tanıda yardımcı olabilir biyolojik olarak hizmet verebilir.
Burada kantitatif kan ve hücre kültür ortamı içinde salgılanan exosomes gelen miRNA'lar ve haberci RNA'lar (mRNA) analiz için prosedür anlatacağız. Saf exosomes exos için western blot analizi ile karakterize olacakilgi mRNA için OMAL işaretleri ve PCR. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve immunogold etiketleme exosomal morfolojisi ve bütünlüğünü doğrulamak için kullanılacaktır. Toplam RNA biz aynı örnekten mRNA ve miRNA hem eğitim sağlamak için bu exosomes arınmış olacaktır. Bioanalyzer RNA bütünlüğünü doğrulayarak sonra, Taqman Alçak Yoğunluk Array (TLDA) kartları ve ilgi transkript için gen ekspresyon çalışmaları kullanarak exosomal miRNA tanımlamak için orta düzeyde kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) gerçekleştirir.
Bu protokoller, farmakolojik müdahale öncesi ve sonrasında, kemirgen modelleri ve hücre kültür ortamı içinde exosomal miRNAs değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir. Exosomal içeriği nedeniyle kökenli kaynağı ve salgılayan exosomes bu hücrelerin fizyolojik koşullara değişir. Bu varyasyonlar hücreler ve sistemler stres veya fizyolojik değişimleri ile baş nasıl fikir sağlayabilir. Bizim temsilcisi veri v gösteriyormiRNA'lar içinde ariations fare kan, insan kanı ve insan hücre kültürü ortamı arındırılmış exosomes mevcut.
Burada kantitatif kan ve hücre kültür ortamı içinde salgılanan exosomes gelen miRNA'lar ve haberci RNA'lar (mRNA) analiz için prosedür anlatacağız. Saf exosomes ilgi mRNA için exosomal işaretleri ve PCR için western blot analizi ile karakterize edilecektir. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve immunogold etiketleme exosomal morfolojisi ve bütünlüğünü doğrulamak için kullanılacaktır. Toplam RNA biz aynı örnekten mRNA ve miRNA hem eğitim sağlamak için bu exosomes arınmış olacaktır. Bioanalyzer RNA bütünlüğünü doğrulayarak sonra, Taqman Alçak Yoğunluk Array (TLDA) kartları ve ilgi transkript için gen ekspresyon çalışmaları kullanarak exosomal miRNA tanımlamak için orta düzeyde kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) gerçekleştirir.
Bu protokoller exosomal miRNAs değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir ifarmakolojik müdahale öncesi ve sonrası n hasta, kemirgen modelleri ve hücre kültür ortamı. Exosomal içeriği nedeniyle kökenli kaynağı ve salgılayan exosomes bu hücrelerin fizyolojik koşullara değişir. Bu varyasyonlar hücreler ve sistemler stres veya fizyolojik değişimleri ile baş nasıl fikir sağlayabilir. Bizim temsilcisi veri miRNA'lar farklılıklar fare kan, insan kanı ve insan hücre kültürü ortamı arındırılmış exosomes mevcut göstermek
Introduction
Kısa noncoding miRNA'lar hedef mRNA bağlanarak gen modüle. ~ 7 baz çifti tamamlayıcılığı tohum sırası çevirinin engellenmesi ya da hedef proteinin 1 azalmış ekspresyonu neden olabilir, her ikisi de mRNA, kararlılığını azalma ile sonuçlanan hedef mRNA bağlamak için MiRNA sağlar. Son on yılda Araştırma tümden hücresel fonksiyonları aracılık miRNA'lar için temel bir rol kanıtlamıştır. Ayrıca çeşitli hastalıklar 2,3 altında yatan miRNA aracılı moleküler değişiklikler diseksiyon yönelik önemli çaba olmuştur. Ayrıca, vücut sıvıları 4-6 istikrarlı miRNA'lar son belirlenmesi klinik tanı için uygun yeni biyolojik olarak kendi kullanımı için yolu açtı.
Vücut sıvıları içinde miRNA ulaşım bir mod sistemik kan dolaşımdaki ile alıcı hücrelere exosomes, mRNA taşıyan küçük kesecikler, protein, lipid arabulucular ve miRNA'lar üzerinden gerçekleştiriliriyon 7-14. Alıcı hücrelerde gen ifadesinin modülasyonunda ve bu sonuçlar hücresel iletişim için yeni bir mekanizmayı temsil etmektedir. Örneğin, hücre büyüme faktörü-β5 (TGFβ5) dönüşüm, salgılayan ve / veya interlökin-1β (IL1β), tümör nekroz faktörü-α (TNF) gibi inflamasyon dahil biyomoleküllerin içeren emici exosomes tarafından immün-düzenleyici işlemleri modüle ve olabilir Bu genlerin 13 düzenleyen miRNA'lar. Anormal miRNA ifade insan hastalıklarının çeşitli ortak bir özelliktir gibi, bu moleküller yeni tedavi hedefleri 2 keşif ve doğrulama için heyecan verici yeni fırsatlar sunmaktadır.
Dolaşım miRNA'ların tüm vücut sıvılarında mevcut olan ve exosomes kompozisyonu, serbest bırakıldıktan hangi kaynak hücrelere göre farklı olduğu bilinmektedir. Böylece, hücrelerin fizyolojik durumunu incelemek için bir yol sunar ve nasıl hücrelerde bile sinyal değişiklik gösterecektirhastalıklar da dahil olmak üzere strese yanıt olarak ts. Exosome kompozisyon değişiklikler okuyan sinyal iletimi ilişkin bilgi sağlar ve biyolojik ya da terapötik müdahale yolları olarak potansiyellerini programını araştırabilirsiniz.
Burada yayınlanan protokollere dayalı birden fazla kaynaktan exosomes en arıtma gösterecektir. Bu exosomes exosomes mevcut miRNAs seviyelerini tespit etmek ve ölçmek için QPCR ardından RNA izolasyonu için kullanılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, kan ve kültür ortamından diferansiyel santrifüj saflaştırılmış exosomes gelen miRNA'lar ve mRNA miktarının gösterir. Exosomes kökenlerine bağlı çeşitli bileşenleri ve immün yanıt, antijen sunumu, hücre içi iletişim ve RNA ve protein 9,11,12,19,20 devri de dahil olmak üzere biyolojik fonksiyonları, bir dizi olarak katılıyor. Büyüklüğü ve şekli exosome saflık belirleyici iken EM exosomes veri gösteren bir dizi çalışma, bu veziküller da tespit için kullan?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Rita Allen Vakfı hibe Seena Ajit fon tarafından desteklenmiştir. Yazarlar alet kullanımı, bilimsel ve teknik yardım için Güney Carolina Elektron Mikroskopi Merkezi Üniversitesi'nden Erika Balogh ve Dr Soumitra Ghoshroy kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) | BD Diagnostics | 366643 | For exosome purification from human blood |
| EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) | BD Diagnostics | 367841 | For exosome purification from mouse blood |
| PAXgene Blood RNA Tube | BD Diagnostics | 762165 | For miRNA isolation from total blood |
| miRVana microRNA isolation kit | Ambion | AM1561 | |
| Acid-Phenol: CHCl3 | Ambion | 9721G | |
| DNase 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | For TLDA cards |
| Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
| Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444747 | |
| Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 | Applied Biosystems | 4444909 | |
| Megaplex RT Human Pool set V3.0 | Applied Biosystems | 4444745 | |
| Megaplex Preamp human pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444748 | |
| Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | |
| Taqman MicroRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366596 | |
| Taqman fast universal PCR master mix | Applied Biosystems | 4366072 | For mRNA qRT-PCR |
| Tumor necrosis factor (primer probe) | Applied Biosystems | Hs01113624_g1 | |
| Vascular endothelial growth factor A (primer probe) | Applied Biosystems | Hs00900055_m1 | |
| Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR | Thermo Scientific | K1642 | For mRNA |
| HSP70 antibody | Abcam | ab94368 | For western blot |
| Anti-rabbit IgG-Gold | Sigma | G7402 | For electron microscopy |
| Rabbit-anti CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
| Nickel 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Ni | |
| Copper 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
| Table 1. Table of specific reagents. |
Referências
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
- Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature reviews. Genetics. 12, 861-874 (2011).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10513-10518 (2008).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell research. 18, 997-1006 (2008).
- Gilad, S., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PloS one. 3, e3148 (2008).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature. 2, 282 (2011).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9, 654-659 (2007).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
- Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. J. Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).
- Ramachandran, S., Palanisamy, V. Horizontal transfer of RNAs: exosomes as mediators of intercellular communication. Wiley Interdiscip Rev. RNA. , (2011).
- Record, M., Subra, C., Silvente-Poirot, S., Poirot, M. Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectors. Biochem Pharmacol. 81, 1171-1182 (2011).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9, 581-593 (2009).
- Ludwig, A. K., Giebel, B. Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication. The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 11-15 (2012).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 22 (2006).
- Masyuk, A. I., et al. Biliary exosomes influence cholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through interaction with primary cilia. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 299, G990-G999 (2010).
- Fauré, J., et al. Exosomes are released by cultured cortical neurones. Molecular and Cellular Neuroscience. 31, 642-648 (2006).
- Waldenstrom, A., Genneback, N., Hellman, U., Ronquist, G. Cardiomyocyte microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells. PloS one. 7, e34653 (2012).
- Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics. 6, 267-283 (2009).
- Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic acids research. 39, 7223-7233 (2011).
- El-Andaloussi, S., et al. Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo. Nature. 7, 2112-2126 (2012).
- Singh, P. P., Smith, V. L., Karakousis, P. C., Schorey, J. S. Exosomes isolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo. J. Immunol. 189, 777-785 (2012).
- Etheridge, A., Lee, I., Hood, L., Galas, D., Wang, K. Extracellular microRNA: A new source of biomarkers. Mutat. Res. , (2011).
- Stenvang, J., Silahtaroglu, A. N., Lindow, M., Elmen, J., Kauppinen, S. The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics. Seminars in cancer biology. 18, 89-102 (2008).
- Mathivanan, S., Fahner, C. J., Reid, G. E., Simpson, R. J. ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids. Nucleic acids research. 40, D1241-D1244 (2012).
