Purificação e microRNA Profiling de Exosomes derivados do sangue e Meios de Cultura

Resumo

A presença de microRNAs (miRNAs estáveis) em exossomos gerou enorme interesse como um novo modo de comunicação intercelular, pela sua utilidade potencial como biomarcadores e como uma rota para a intervenção terapêutica. Aqui demonstramos purificação exosome de mídia e cultura de sangue, seguido por PCR quantitativo para identificar os miRNAs sendo transportados.

Resumo

MiRNAs estáveis ​​estão presentes em todos os fluidos do corpo e em alguns miRNAs circulantes são protegidos da degradação por sequestração em pequenas vesículas chamadas exosomes. Exosomes podem fundir com a membrana plasmática que resulta na transferência de RNA e proteínas da célula-alvo. As suas funções biológicas incluem resposta imune, a apresentação de antigénio, e a comunicação intracelular. Entrega de miRNAs que podem regular a expressão do gene em células receptoras através do sangue, abriu novas possibilidades para intervenção alvo. Além de oferecer uma estratégia para a entrega de medicamentos ou agentes terapêuticos RNA, o conteúdo exosomal podem servir como biomarcadores que podem ajudar no diagnóstico, determinar as opções de tratamento e prognóstico.

Aqui vamos descrever o procedimento para analisar quantitativamente miRNAs e RNAs mensageiro (mRNA) de exossomos secretados no sangue e meio de cultura de células. Purificados exosomes será caracterizado através da análise de western blot para exosmarcadores Omal e PCR para mRNAs de interesse. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e immunogold rotulagem será usado para validar exosomal morfologia e integridade. O RNA total será purificada a partir destes exosomes para assegurar que podemos estudar tanto mRNA e miRNA partir da mesma amostra. Depois de validar a integridade do RNA por Bioanalyzer, vamos realizar um meio de transferência quantitativa PCR em tempo real (qPCR) para identificar o miRNA exosomal usando Taqman Matriz de Baixa Densidade (TLDA) cartas e estudos de expressão gênica de transcrições de interesse.

Estes protocolos podem ser utilizados para quantificar as alterações na miRNAs exosomal em pacientes, modelos de roedor e meios de cultura de células antes e após a intervenção farmacológica. Conteúdo exosomal variar devido à fonte de origem e as condições fisiológicas de células que secretam exossomos. Essas variações podem fornecer uma visão sobre como as células e os sistemas de lidar com o estresse ou perturbações fisiológicas. Nossos dados representativos mostrar variations em miRNAs apresentam em exossomos purificados a partir do sangue mouse, sangue humano e os meios de cultura de células humanas.

Aqui vamos descrever o procedimento para analisar quantitativamente miRNAs e RNAs mensageiro (mRNA) de exossomos secretados no sangue e meio de cultura de células. Purificados exosomes será caracterizado através da análise de western blot para marcadores exosomal e PCR para mRNAs de interesse. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e immunogold rotulagem será usado para validar exosomal morfologia e integridade. O RNA total será purificada a partir destes exosomes para assegurar que podemos estudar tanto mRNA e miRNA partir da mesma amostra. Depois de validar a integridade do RNA por Bioanalyzer, vamos realizar um meio de transferência quantitativa PCR em tempo real (qPCR) para identificar o miRNA exosomal usando Taqman Matriz de Baixa Densidade (TLDA) cartas e estudos de expressão gênica de transcrições de interesse.

Estes protocolos podem ser utilizados para quantificar as alterações na miRNAs exosomal in pacientes, modelos de roedores e meios de cultura de células antes e depois da intervenção farmacológica. Conteúdo exosomal variar devido à fonte de origem e as condições fisiológicas de células que secretam exossomos. Essas variações podem fornecer uma visão sobre como as células e os sistemas de lidar com o estresse ou perturbações fisiológicas. Nossos dados representativos mostram variações em miRNAs apresentam em exossomos purificados a partir do sangue mouse, sangue humano e os meios de cultura de células humanas

Introdução

MiRNAs noncoding Curtas modular a expressão do gene por ligação ao ARNm alvo. Semente sequência complementaridade de pares de bases ~ 7 permite miRNA se liguem ao ARNm alvo, resultando na inibição da tradução ou na redução na estabilidade do mRNA, o que pode resultar na diminuição da expressão da proteína alvo ^1. Pesquisas na última década tem se mostrado inequivocamente um papel fundamental para miRNAs em mediar funções celulares. Também tem havido considerável esforço dirigido para dissecar miRNA alterações moleculares subjacentes a diversas doenças mediadas por ^2,3. Além disso, a recente identificação de miRNAs estáveis ​​em fluidos corporais....

Protocolo

Todos os experimentos com amostras de sangue de humanos e roedores foram executados em conformidade com todas as diretrizes, regulamentos e agências reguladoras. Seres humanos foram registrados após o consentimento informado aprovado pela Drexel University College of Medicine Institutional Review Board e todos os procedimentos de estudos realizados com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use Drexel.

1. Purificação exossomo de sangue (~ 5,5 h)

DICAS

• Nós ressuspender exossomos a partir de um tubo de sangue (~ 10 ml de sangue humano e ~ 2 ml de sangue mo....

Resultados

Após o isolamento exosomes de meios de cultura de sangue ou de células, a pureza das exosomes pode ser testado por microscopia electrónica (ME) e Western blot (Figuras 1A e 1B). Confirmámos a nossa preparação exosome partir de várias fontes com EM e western blot utilizando anticorpos múltiplos. Figura 1A mostra imagens EM confirmando que exosomes estão intactas com um diâmetro de 30 ~ -100 nm e contêm CD81 por imuno rotulagem. Marcadores exosomal comumente utilizados sã.......

Discussão

Neste protocolo, vamos mostrar a quantificação dos miRNAs e mRNAs de exossomos purificados por centrifugação diferencial dos meios de sangue e cultura. Exosomes têm diversos componentes que dependem da sua origem e estão envolvidos em várias funções biológicas, incluindo a resposta imunológica, a apresentação de antigénio, a comunicação intracelular, bem como a transferência de RNA e proteínas ^{9,11,12,19,20.} Embora a forma e tamanho é um determinante de pureza exossomo, uma série de artigos que mostram dados .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Vacutainer revestido com EDTA (tubos de 10 ml)	BD Diagnostics	366643	Para purificação de exossomos de sangue humano
Vacutainer revestido com EDTA (tubos de 2 ml)	BD Diagnostics	367841	Para purificação de exossomos de sangue de camundongo Tubo de
RNA de sangue PAXgene	BD Diagnostics	762165	Para isolamento de miRNA de sangue total kit de
isolamento de microRNA miRVana	Ambion	AM1561
Ácido-fenol: CHCl3	Ambion	9721G
DNase 1	Qiagen	79254
TaqMan Universal PCR Master Mix, Sem AmpErase UNG	Applied Biosystems	4326614	Para cartões TLDA
Conjunto de piscina de roedores Megaplex RT v3.0	Applied Biosystems	4444746
Conjunto de piscina de roedores de pré-amplificador Megaplex v3.0	Applied Biosystems		Conjunto de
MicroRNA A+B para roedores 4444747 Taqman Array V3.0	de
Megaplex RT da Applied Biosystems V3.0	de
Applied Biosystems	v3.0	de
v3.0	Applied Biosystems	4444913
Taqman Kit MicroRNA RT	Applied Biosystems	4366596
Taqman fast universal PCR master mix	Applied Biosystems	4366072	Para mRNA qRT-PCR
Fator de necrose tumoral (sonda de primer)	Applied Biosystems	Hs01113624_g1
Fator de crescimento endotelial vascular A (sonda de primer)	Applied Biosystems	Hs00900055_m1
Maxima First Strand cDNA Kit de síntese para RT-qPCR	Thermo Scientific	K1642	para anticorpo de mRNA
HSP70	Abcam	ab94368	para western blot
Anti-coelho IgG-Gold	Sigma	G7402	Para microscopia eletrônica
Coelho-anti CD81	Sigma	SAB3500454
Níquel 300 malha de carbono formvar grades	Microscopia eletrônica Ciências	FCF300-Ni
Grades formvar de carbono de cobre 300 mesh	Ciências de Microscopia Eletrônica	FCF300-
Tabela 1. Tabela de reagentes específicos.

Conjunto piscina humana 4444909 Conjunto piscina humana de pré-amplificador 4444745 Megaplex da Conjunto cartões A+B de microRNA humano Taqman Array da Applied Biosystems 4444748