外来体的纯化和microRNA剖析来源于血液和文化传媒
Summary
存在稳定的microRNA（miRNA的）外来间通讯作为一种新型的模式产生了巨大的兴趣，为他们的潜在效用作为生物标志物和治疗干预的路由。在这里，我们展示了切体净化血液和文化传媒定量PCR确定的miRNA被运。
Abstract
稳定的miRNA是目前在所有的体液和一些循环miRNA是封存在小囊，称为外来免受降解。外来体可以在RNA和蛋白质转移到目标小区与质膜融合。它们的生物学功能包括免疫反应，抗原呈递细胞内的通信。受体细胞通过血液，可以调节基因表达的miRNA交付开辟了新的途径为目标的干预。除了提供交付药物或RNA的治疗药物的战略，exosomal内容可以作为生物标志物，可以帮助诊断，确定治疗方案和预后。
在这里，我们将介绍的程序定量分析miRNA和外来的信使RNA（mRNA）的分泌在血液和细胞培养基。纯化的外来的特点将是使用免疫印迹分析EXOS的OMAL标记和PCR检测mRNA的兴趣。透射电子显微镜（TEM）和免疫金标记将被使用的，来验证exosomal的形态和完整性。从这些外来体将纯化总RNA，以确保我们可以从相同的样本研究的mRNA和miRNA。验证RNA的完整性，生物分析仪后，我们会进行一个中等通量定量实时PCR（qPCR）的使用Taqman探针低密度阵列卡（TLDA）和基因表达研究感兴趣的成绩单，识别exosomal miRNA的。
这些协议可以用于量化的患者中，啮齿动物模型和药物干预前，后的细胞培养基改变exosomal的miRNA。不同的Exosomal内容来源及细胞分泌外来体的生理条件。这些变化，可以了解单元和系统如何应对压力或生理扰动。我们的有代表性的数据展示Variations的miRNA纯化小鼠血液，人体血液和人体细胞的培养基中存在的外来。
在这里，我们将介绍的程序定量分析miRNA和外来的信使RNA（mRNA）的分泌在血液和细胞培养基。纯化的外来的特点将是感兴趣的mRNA的的exosomal标记和PCR使用免疫印迹分析。透射电子显微镜（TEM）和免疫金标记将被使用的，来验证exosomal的形态和完整性。从这些外来体将纯化总RNA，以确保我们可以从相同的样本研究的mRNA和miRNA。验证RNA的完整性，生物分析仪后，我们会进行一个中等通量定量实时PCR（qPCR）的使用Taqman探针低密度阵列卡（TLDA）和基因表达研究感兴趣的成绩单，识别exosomal miRNA的。
这些协议可以用来量化的改变，在exosomal miRNA的我Ñ患者，啮齿类动物模型，药物干预前后细胞培养基。不同的Exosomal内容来源及细胞分泌外来体的生理条件。这些变化，可以了解单元和系统如何应对压力或生理扰动。我们的有代表性的数据显示变化的miRNA存在于外来鼠标血，人体血液和人体细胞培养介质纯化
Introduction
短期非编码的miRNA调节基因表达靶mRNA结合。种子序列〜7个碱基对的互补性使miRNA的结合到靶mRNA，导致翻译抑制或减少的mRNA的稳定性，这两者都可以导致靶蛋白1的表达减少。在过去十年的研究明确证明的基础性作用的miRNA介导细胞功能。同时也出现了相当大的努力，朝向解剖的miRNA介导的分子变化相关的各种疾病2,3。此外，最近鉴定稳定的miRNA在体液4-6铺平了道路，利用他们作为新型生物标志物，适合于临床诊断。
外来体，小囊泡携带基因，蛋白质，脂类介质，和miRNA通过全身血液circulat的受体细胞是通过体液中miRNA的运输模式之一离子7-14。这将导致在受体细胞的基因表达的调制和蜂窝通信代表了一种新的机制。例如，细胞可以调节分泌和/或参与炎症如白细胞介素-1β（IL1β），肿瘤坏死因子-α（TNFα）的含有生物分子的吸收外来的免疫调节过程，转化生长因子-β5（TGFβ5），并调节这些基因的miRNA 13。由于miRNA表达异常在人体多种疾病的共同特点是，这些分子的发现和验证新的治疗目标2提供了激动人心的新机遇。
循环miRNA是存在的所有体液中，它被称为外来的组成是不同的，根据他们被释放源细胞。因此，他们提供了一个途径来研究细胞的生理状况和细胞改变信号甚至TS压力，包括疾病。研究切体成分的改变，可以提供洞察信号转导，并探讨其潜在效用作为生物标志物或治疗干预航线。
在这里，我们将展示发布的协议的基础上，从多个来源的外来的净化。这些将用于RNA分离qPCR的识别和测量水平的miRNA存在于外来外来。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这个协议中，我们展示了通过差速离心纯化的外来从血和文化媒体的miRNA和mRNA的定量。外来体取决于其原产地有不同的组成部分，并参与了一些生物功能，包括免疫反应，抗原呈递细胞内的沟通，转移RNA和蛋白质9,11,12,19,20。大小和形状是外切体纯度的一个决定性因素，一些论文EM外来的数据表明，这些囊泡的范围可以在大小和形态的基础上从哪个源分泌，以及用于固定的方法和成像…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究是支持的资金丽塔艾伦基金会授予Seena阿吉特。笔者想从南卡罗来纳州电子显微镜仪器的使用，科学和技术援助中心大学的埃里卡巴洛格和Soumitra Ghoshroy博士的承认。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) | BD Diagnostics | 366643 | For exosome purification from human blood |
| EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) | BD Diagnostics | 367841 | For exosome purification from mouse blood |
| PAXgene Blood RNA Tube | BD Diagnostics | 762165 | For miRNA isolation from total blood |
| miRVana microRNA isolation kit | Ambion | AM1561 | |
| Acid-Phenol: CHCl3 | Ambion | 9721G | |
| DNase 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | For TLDA cards |
| Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
| Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444747 | |
| Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 | Applied Biosystems | 4444909 | |
| Megaplex RT Human Pool set V3.0 | Applied Biosystems | 4444745 | |
| Megaplex Preamp human pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444748 | |
| Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | |
| Taqman MicroRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366596 | |
| Taqman fast universal PCR master mix | Applied Biosystems | 4366072 | For mRNA qRT-PCR |
| Tumor necrosis factor (primer probe) | Applied Biosystems | Hs01113624_g1 | |
| Vascular endothelial growth factor A (primer probe) | Applied Biosystems | Hs00900055_m1 | |
| Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR | Thermo Scientific | K1642 | For mRNA |
| HSP70 antibody | Abcam | ab94368 | For western blot |
| Anti-rabbit IgG-Gold | Sigma | G7402 | For electron microscopy |
| Rabbit-anti CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
| Nickel 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Ni | |
| Copper 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
| Table 1. Table of specific reagents. |
Referências
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