Zuivering en microRNA Profilering van Exosomes Afgeleid van Blood en cultuur Media
Summary
De aanwezigheid van stabiele microRNA (miRNA) in exosomes heeft immense belangstelling gegenereerd als een nieuwe wijze van intercellulaire communicatie, voor hun potentiële nut als biomarkers en als een route voor therapeutische interventie. Hier laten we zien exosome zuivering van het bloed en de cultuur media, gevolgd door kwantitatieve PCR om miRNA's worden vervoerd identificeren.
Abstract
Stabiele miRNA's zijn aanwezig in alle lichaamsvloeistoffen en sommige circulerende miRNA's worden beschermd tegen afbraak door vastlegging in kleine blaasjes genaamd exosomes. Exosomes kunnen fuseren met de plasmamembraan leidt tot de overdracht van RNA en eiwitten aan de doelcel. Hun biologische functies zijn immuunrespons antigeenpresentatie en intracellulaire communicatie. Levering van miRNAs die genexpressie kan reguleren in de ontvangende cellen via het bloed heeft nieuwe wegen voor doel interventie geopend. Naast het aanbieden van een strategie voor de levering van drugs of RNA therapeutische middelen, kunnen exosomaal inhoud dienen als biomarkers die kunnen helpen bij de diagnose, het bepalen van behandelingsmogelijkheden en prognose.
Hier zullen we de procedure beschrijven voor het kwantitatief analyseren van miRNAs en messenger RNA (mRNA) uit exosomes uitgescheiden in het bloed en de media voor celkweek. Gezuiverde exosomes zal worden gekarakteriseerd met behulp van western blot analyse voor exosomal markers en PCR voor mRNA's die van belang zijn. Transmissie elektronenmicroscopie (TEM) en immuno labeling wordt gebruikt om exosomal morfologie en integriteit valideren. Totaal RNA wordt gezuiverd van deze exosomes om ervoor te zorgen dat we zowel mRNA en miRNA uit hetzelfde monster kunnen bestuderen. Na RNA integriteit valideren door Bioanalyzer, zullen we een middelgrote doorvoer kwantitatieve real time PCR (qPCR) uit te voeren om de exosomaal miRNA met Taqman Low Density Array (TLDA) kaarten en genexpressie studies voor transcripties van belang te identificeren.
Deze protocollen kunnen worden gebruikt om wijzigingen in exosomal miRNAs kwantificeren patiënten diermodellen en celkweekmedium voor en na farmacologische interventie. Exosomaal inhoud variëren afhankelijk van de bron van herkomst en de fysiologische omstandigheden van cellen die afscheiden exosomes. Deze variaties kunnen inzicht geven over hoe cellen en systemen omgaan met stress of fysiologische verstoringen. Onze representatieve gegevens tonen variations in miRNAs presenteren exosomes gezuiverd uit muizen bloed, menselijk bloed en menselijke celkweek media.
Hier zullen we de procedure beschrijven voor het kwantitatief analyseren van miRNAs en messenger RNA (mRNA) uit exosomes uitgescheiden in het bloed en de media voor celkweek. Gezuiverde exosomes zal worden gekarakteriseerd met behulp van western blot analyse voor exosomaal markers en PCR voor mRNA's van belang zijn. Transmissie elektronenmicroscopie (TEM) en immuno labeling wordt gebruikt om exosomal morfologie en integriteit valideren. Totaal RNA wordt gezuiverd van deze exosomes om ervoor te zorgen dat we zowel mRNA en miRNA uit hetzelfde monster kunnen bestuderen. Na RNA integriteit valideren door Bioanalyzer, zullen we een middelgrote doorvoer kwantitatieve real time PCR (qPCR) uit te voeren om de exosomaal miRNA met Taqman Low Density Array (TLDA) kaarten en genexpressie studies voor transcripties van belang te identificeren.
Deze protocollen kunnen worden gebruikt om veranderingen in exosomaal miRNAs kwantificeren in patiënten, knaagdier modellen en celcultuurmedia voor en na farmacologische interventie. Exosomaal inhoud variëren afhankelijk van de bron van herkomst en de fysiologische omstandigheden van cellen die afscheiden exosomes. Deze variaties kunnen inzicht geven over hoe cellen en systemen omgaan met stress of fysiologische verstoringen. Onze representatieve gegevens tonen variaties in miRNAs presenteren exosomes gezuiverd uit muizen bloed, menselijk bloed en menselijke celcultuurmedia
Introduction
Korte noncoding miRNAs moduleren genexpressie door te binden aan het doelwit mRNA. Zaad sequentiecomplementariteit van ~ 7 basenparen kunnen miRNA te binden aan het doel-mRNA resulteert in de remming van translatie of vermindering van de stabiliteit van het mRNA, die beide kunnen leiden tot verminderde expressie van het doeleiwit 1. Onderzoek van de afgelopen tien jaar heeft ondubbelzinnig een fundamentele rol voor miRNAs bewezen in het bemiddelen cellulaire functies. Er is ook een aanzienlijke inspanning gericht op het ontleden van miRNA gemedieerde moleculaire veranderingen ten grondslag liggen aan diverse ziekten 2,3. Bovendien recente identificatie van stabiele miRNAs in lichaamsvloeistoffen 4-6 maakte de weg vrij voor het gebruik ervan als nieuwe biomarkers vatbaar voor klinische diagnose.
Het ene vervoermiddel miRNA in lichaamsvloeistoffen is via exosomes, kleine blaasjes die mRNA's dragen, proteïnen, lipiden bemiddelaars, en miRNAs aan ontvanger cellen via systemische bloion 7-14. Dit resulteert in modulatie van genexpressie in ontvangende cellen en vertegenwoordigt een nieuw mechanisme van cellulaire communicatie. Bijvoorbeeld kunnen cellen immuun-regulerende processen moduleren secreteren en / of absorberen van exosomen bevattende biomoleculen van inflammatie zoals interleukine-1β (IL1β), tumor necrosis factor-α (TNFa), transformerende groeifactor-β5 (TGFβ5) en de miRNAs dat deze genen reguleren 13. Zoals afwijkende miRNA expressie is een gemeenschappelijk kenmerk in een verscheidenheid van ziekten bij de mens, deze moleculen bieden opwindende nieuwe mogelijkheden voor de ontdekking en validatie van nieuwe therapeutische doelwitten 2.
Circulerende miRNAs zijn in alle lichaamsvloeistoffen en het is bekend dat de samenstelling van exosomes verschilt zich uitgaande van de cellen waaruit ze werden vrijgelaten. Zo bieden zij een laan naar de fysiologische toestand van de cellen te bestuderen en hoe de cellen zelfs alter signaleringts in reactie op stress, waaronder ziekten. Studeren veranderingen in exosome samenstelling kan inzicht geven in signaaltransductie en onderzoeken hun potentiële nut als biomarkers of therapeutische interventie routes.
Hier zullen we de zuivering van exosomes uit meerdere bronnen op basis van gepubliceerde protocollen te tonen. Deze exosomes zullen worden gebruikt voor RNA-isolatie gevolgd door qPCR om de niveaus van miRNAs in de exosomes identificeren en te meten.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol, tonen we de kwantificering van miRNAs en mRNA's van exosomes gezuiverd door differentiële centrifugatie uit bloed en cultuur media. Exosomes hebben verschillende componenten afhankelijk van hun oorsprong en zijn betrokken bij een aantal biologische functies, waaronder immuunrespons antigeenpresentatie, intracellulaire communicatie, en de overdracht van RNA en eiwitten 9,11,12,19,20. Terwijl and size bepalend is exosome zuiverheid, een aantal documenten met EM-gegevens van exosomes blijkt…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door fondsen van Rita Allen Stichting subsidie aan Seena Ajit. De auteurs willen graag Erika Balogh en Dr Soumitra Ghoshroy erkennen van de Universiteit van South Carolina Electron Microscopy Center te gebruiken instrument, wetenschappelijke en technische bijstand.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) | BD Diagnostics | 366643 | For exosome purification from human blood |
| EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) | BD Diagnostics | 367841 | For exosome purification from mouse blood |
| PAXgene Blood RNA Tube | BD Diagnostics | 762165 | For miRNA isolation from total blood |
| miRVana microRNA isolation kit | Ambion | AM1561 | |
| Acid-Phenol: CHCl3 | Ambion | 9721G | |
| DNase 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | For TLDA cards |
| Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
| Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444747 | |
| Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 | Applied Biosystems | 4444909 | |
| Megaplex RT Human Pool set V3.0 | Applied Biosystems | 4444745 | |
| Megaplex Preamp human pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444748 | |
| Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | |
| Taqman MicroRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366596 | |
| Taqman fast universal PCR master mix | Applied Biosystems | 4366072 | For mRNA qRT-PCR |
| Tumor necrosis factor (primer probe) | Applied Biosystems | Hs01113624_g1 | |
| Vascular endothelial growth factor A (primer probe) | Applied Biosystems | Hs00900055_m1 | |
| Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR | Thermo Scientific | K1642 | For mRNA |
| HSP70 antibody | Abcam | ab94368 | For western blot |
| Anti-rabbit IgG-Gold | Sigma | G7402 | For electron microscopy |
| Rabbit-anti CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
| Nickel 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Ni | |
| Copper 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
| Table 1. Table of specific reagents. |
Referências
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
- Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature reviews. Genetics. 12, 861-874 (2011).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10513-10518 (2008).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell research. 18, 997-1006 (2008).
- Gilad, S., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PloS one. 3, e3148 (2008).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature. 2, 282 (2011).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9, 654-659 (2007).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
- Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. J. Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).
- Ramachandran, S., Palanisamy, V. Horizontal transfer of RNAs: exosomes as mediators of intercellular communication. Wiley Interdiscip Rev. RNA. , (2011).
- Record, M., Subra, C., Silvente-Poirot, S., Poirot, M. Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectors. Biochem Pharmacol. 81, 1171-1182 (2011).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9, 581-593 (2009).
- Ludwig, A. K., Giebel, B. Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication. The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 11-15 (2012).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 22 (2006).
- Masyuk, A. I., et al. Biliary exosomes influence cholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through interaction with primary cilia. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 299, G990-G999 (2010).
- Fauré, J., et al. Exosomes are released by cultured cortical neurones. Molecular and Cellular Neuroscience. 31, 642-648 (2006).
- Waldenstrom, A., Genneback, N., Hellman, U., Ronquist, G. Cardiomyocyte microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells. PloS one. 7, e34653 (2012).
- Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics. 6, 267-283 (2009).
- Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic acids research. 39, 7223-7233 (2011).
- El-Andaloussi, S., et al. Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo. Nature. 7, 2112-2126 (2012).
- Singh, P. P., Smith, V. L., Karakousis, P. C., Schorey, J. S. Exosomes isolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo. J. Immunol. 189, 777-785 (2012).
- Etheridge, A., Lee, I., Hood, L., Galas, D., Wang, K. Extracellular microRNA: A new source of biomarkers. Mutat. Res. , (2011).
- Stenvang, J., Silahtaroglu, A. N., Lindow, M., Elmen, J., Kauppinen, S. The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics. Seminars in cancer biology. 18, 89-102 (2008).
- Mathivanan, S., Fahner, C. J., Reid, G. E., Simpson, R. J. ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids. Nucleic acids research. 40, D1241-D1244 (2012).
